0 引言

肺癌是世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤^[1]，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌最常见的病理类型^[2]。放疗是肺癌治疗的重要手段之一，但放射抵抗的存在往往限制了非小细胞肺癌治疗效果，因此探寻肺癌放疗抵抗的新靶标及其潜在分子机制有着重要意义。

整合素是一种跨膜黏附受体，由α和β两个亚基组成。细胞与细胞外基质的黏附主要通过整合素家族实现^[3]。整合素可以与多种胞质蛋白结合形成复合物，将信号从胞内区传递到胞外区，介导信号转导，在细胞迁移、侵袭、分化、增殖和凋亡相关基因的表达中发挥重要作用^[4]。整合素信号增强了癌细胞抵抗化学疗法和放射疗法有害作用的能力^[5]。Integrin αV（ITGAV）属于整合素家族一员，与多种肿瘤的发生、发展及不良预后密切相关，但其与NSCLC放射抵抗的关系尚未见报道。

本研究通过公共数据库分析ITGAV在NSCLC中的表达及与患者生存之间的关系，并在细胞水平上验证了ITGAV对NSCLC细胞放射敏感度的影响。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

人肺腺癌细胞株H1299、A549购自中科院上海细胞库。ITGAV-siRNA-2913、ITGAV-siRNA-1951、ITGAV-siRNA-1312和阴性对照Negative control FAM均由上海吉玛公司合成。抗体均购自美国BOSTER公司。DMEM培养基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司。蛋白裂解液RIPA、5×蛋白上样缓冲液、BCA蛋白浓度检测试剂盒等均购自碧云天生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 GEPIA数据库分析

进入GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/），输入基因名称ITGAV后，在Datasets Selection窗口选择“LUAD”、“LUSC”；设置临界值设定条件（|Log₂FC|Cutoff：0.5，P value Cutoff：0.05），点击“plot”获取基因表达差异图谱。

1.2.2 HPA数据库分析

进入HPA数据库（https://www.proteinatlas.org/），输入基因ITGAV后，点击search，点击“tissue”进入组织图谱，点击“lung”，获取相应的免疫组织化学切片。

1.2.3 Kaplan-Meier Plotter数据库进行在线生存分析

进入Kaplan-Meier Plotter [Lung Cancer]栏目（http:/kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=lung），输入基因ITGAV后，在Survival窗口选择总生存期（OS）和无复发生存期（RFS），在Radiotherapy窗口选择yes，点击Draw Kaplan Meier-plotter，获取生存曲线。

1.2.4 细胞培养

利用FBS浓度为10%的DMEM培养基，于5%CO₂、37℃的细胞培养箱内，培养A549、A549R、H1299和H1299R细胞。

1.2.5 非小细胞肺癌放射抵抗株A549R和H1299R细胞的构建

将处在对数生长期的A549和H1299细胞（5×10⁶个/瓶）接种于培养瓶内，培养瓶内均加入4 ml含PFS为10%的DMEM培养液，在恒温培养箱中培养24 h后，2 Gy剂量X射线累计照射28次，总剂量达到56 Gy（照射能量6 MV，照射距离100 cm，照射野15 cm×15 cm，剂量率2 Gy/min，放疗设备Varian Unique），每次照射完毕后继续恒温箱中培养。照射完毕，对培养瓶中的细胞进行单克隆，稳定传代，得到肺癌放射抵抗株A549R和H1299R。

1.2.6 细胞转染

实验分为ITGAV干扰组和阴性对照组。培养A549R和H1299R细胞使其融合度达50%~70%时，ITGAV siRNA转染：siITGAV的三条干扰序列为：ITGAV-siRNA-2913（F: 5′-CCACAUUGGUUACCACUAATT-3′，R: 5′-UUAGUGGUAACCAAUGUGGTT-3′）；ITGAV-siRNA-1951（F: 5′-CCCUCUGACAUUGAUUGUUTT-3′，R: 5′-AACAAUCAAUGUCAGAGGGTT-3′）；ITGAV-siRNA-1312（F: 5′-GCAGGUCUCAGUGUCUCUATT-3′，R: 5′-UAGAGACACUGAGACCUGCTT-3′）。阴性对照（negative control, NC）序列为：F: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，R: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。收集处于对数生长期的A549R和H1299R细胞，将细胞密度调整为2×10⁵个/毫升，接种在6孔板上，按照siRNA mate说明书转染siITGAV和NC组细胞，收集转染48和72 h后的细胞进行后续实验。

1.2.7 qRT-PCR实验

qRT-PCR实验收集处对数生长期的A549R和H1299R细胞，裂解后依据RNA反转录试剂盒说明书步骤提取RNA，并进行反转录合成cDNA，然后进行PCR反应，PCR反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，40个循环。ITGAV引物序列：F: 5'-ATCTGTGAGGTCGAAACAGGA-3'，R：5'-TGGAGCATACTCAACAGTCTTTG-3'；GAPDH引物序列：F：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，R：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。GAPDH为内参，按照2^-ΔΔCt法计算ITGAV相对表达量。

1.2.8 蛋白提取及Western blot检测

收集约1×10⁶个细胞，提取蛋白，使用BCA法进行定量，取10 μl蛋白，10%SDS-PAGE胶进行电泳，转膜后室温下于5%的脱脂奶粉中封闭2 h。4℃条件下一抗孵育8 h，室温条件下二抗孵育2 h，ECL试剂盒显影。ImagePro Plus 6.0软件统计目的蛋白与内参蛋白灰度值，两者之比即为目的蛋白表达量。

1.2.9 克隆形成实验

ITGAV siRNA和NC转染A549R和H1299R细胞后，经0、2、4、6、8 Gy照射，将生长状态良好的细胞以1×10³个/孔密度传代培养于6孔板中，37℃、5%CO₂恒定培养箱培养7~10天，直到细胞长出新的集落，固定，结晶紫染色后显微镜下计数克隆数。

1.2.10 细胞凋亡检测

A549R和H1299R细胞经ITGAV siRNA、NC转染后，采用6 Gy X射线照射细胞，继续培养24 h后离心，收集细胞，PBS预冷，洗3遍。依照凋亡试剂盒说明书步骤操作，依次进行Annexin V和PI双染色，流式细胞仪统计细胞凋亡率。

1.2.11 细胞周期检测

A549R和H1299R细胞经ITGAV siRNA、NC转染，采用6 Gy X线照射后，收集细胞，预冷的PBS洗3遍。4℃冰箱70%冷乙醇固定过夜，根据细胞周期试剂盒说明书的操作步骤，按顺序进行染色，流式细胞仪检测细胞周期。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.04软件对数据进行分析, 计量数据以（x±s）表示。多组间比较使用单因素方差分析, 两组间比较使用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 NSCLC组织中ITGAV高表达

对TCGA的肺腺癌（共594例，包括59例正常组织和535例肺腺癌组织）及肺鳞癌（共551例，包括49例正常组织和502例肺鳞癌组织）数据的查询显示，ITGAV在肺腺癌（图 1A）和肺鳞癌（图 1B）中过表达（P<0.001）。从HPA数据库检索的免疫组织化学染色数据显示，ITGAV蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达高于正常组织（图 1C）。

2.2 NSCLC组织中ITGAV高表达与预后的关系

ITGAV高表达与肺腺癌患者的OS（HR=1.47, P=0.0091）和RFS（HR=1.78, P=0.0076）不良密切相关，见图 2A~B。但ITGAV的表达与肺鳞癌患者的OS（HR=1.22, P=0.21）和RFS（HR=1.64, P=0.082）无明显相关性，见图 2C~D。提示ITGAV在肺腺癌组织中高表达并与不良预后相关。

2.3 A549R和H1299R细胞放射敏感度检测

与亲本细胞相比，A549R和H1299R细胞经过X射线照射后其放疗抵抗能力增加，见图 3。

2.4 ITGAV在A549R和H1299R细胞中的表达

Western blot结果显示ITGAV在A549R细胞中的表达高于A549细胞（P=0.0003），在H1299R细胞中的表达高于H1299细胞（P<0.0001），见图 4。

2.5 si-RNA转染效率验证

为了研究ITGAV在非小细胞肺癌细胞辐射抗性中的生物学功能，我们用对照（NC）或si-RNA载体（siITGAV-2913、siITGAV-1951、siITGAV-1312）转染A549R和H1299R细胞。通过qRT-PCR和Western blot验证转染效率。qRT-PCR检测结果显示：与NC组（0.96±0.030）相比、siITGAV-2913组（0.32±0.017）、siITGAV-1951组（0.18±0.011）、siITGAV-1312组（0.2367±0.012）mRNA在A549R中相对表达量差异有统计学意义（均P<0.0001），见图 5A；Western blot检测结果显示：A549R和H1299R细胞中，siITGAV-1951、siITGAV-1312、siITGAV-2913均显著抑制了ITGAV蛋白水平的表达，而siITGAV-1951无论是在A549R还是H1299R细胞中，沉默效果最佳（P<0.0001），见图 5B~E。因此，我们选择siITGAV-1951进行后续功能实验。

2.6 抑制ITGAV对肺腺癌细胞克隆形成能力的影响

克隆形成实验结果显示，经0、2、4、6、8 Gy X线照射，ITGAV干扰组细胞的克隆形成能力明显低于阴性对照组（P均<0.05），见图 6。

2.7 抑制ITGAV对肺腺癌细胞凋亡和细胞周期的影响

流式细胞仪凋亡分析显示，ITGAV在无照射条件下对NSCLC细胞凋亡无明显影响。然而，6 Gy X线照射48 h后，A549R-siITGAV和H1299R-siITGAV组的凋亡细胞比例明显高于对照组（P_H1299R<0.0001, P_A549R=0.0002），见图 7A~B。经6 Gy X线照射后，A549R-siITGAV和H1299R-siITGAV细胞的G₂/M期细胞比例高于阴性对照组（P_H1299R<0.0001, P_A549R=0.0007），见图 7C~D。这些结果表明，ITGAV干扰后肺腺癌细胞凋亡率增加、阻滞于G₂/M期的细胞增加。

3 讨论

肿瘤放射抵抗是一个多基因共同调控的复杂生物学过程。文献证实放疗抵抗的发生与DNA损伤修复、细胞周期阻滞、乏氧、逃避凋亡、线粒体能量改变、肿瘤干细胞增殖、亚克隆形成等多种因素相关^[6]。因此，研究非小细胞肺癌放射抵抗的分子生物学机制，寻找放疗抵抗新靶点对提高放射敏感度尤为重要。整合素是一种跨膜糖蛋白，其在肿瘤细胞黏附、改变肿瘤细胞周期、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤血管内皮细胞生成、介导肿瘤细胞侵袭转移等方面发挥重要作用^[7]。ITGAV作为整合素家族一员，目前已被证实与前列腺癌^[8]、胰腺癌^[9]和肝癌^[10]的侵袭、扩散或不良预后有关。Cheuk等^[11]研究显示整合素ITGAV的沉默通过改变BCL2和PXN的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和自我更新。但ITGAV在非小细胞肺癌放射抵抗中的作用尚不清楚。

本研究通过TCGA数据库分析表明，与正常肺组织相比，整合素ITGAV在肺腺癌和肺鳞癌组织中表达明显增加，HPA数据库检索的免疫组织化学染色数据也表明ITGAV蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达高于正常组织，并且通过Kaplan-Meier Plotter数据库发现ITGAV高表达与肺腺癌患者较短OS和RFS有关。这些结果与Loeser等^[12]研究结果一致。

为进一步研究ITGAV与NSCLC放射抵抗关系，本研究干扰了ITGAV在A549R和H1299R细胞中的表达，经不同剂量照射后，发现随着照射剂量增加，干扰组及对照组克隆存活率均显著降低，但与NC组相比，si-ITGAV组克隆形成率下降更为明显。这与Lee等^[13]研究结果相似。他们发现沉默ITGAV后，STAT5的磷酸化下降，NSCLC克隆形成率明显减低。本研究还发现，经6 Gy X线照射后，si-ITGAV组凋亡率、G₂/M期阻滞增加，证明ITGAV的沉默与NSCLC较低克隆存活率、对辐射诱导的凋亡抵抗力下降以及G₂/M期阻滞有关。Li等^[14]研究ITGB1与NSCLC放射抵抗关系时也有相似的结果，他们发现沉默ITGB1后，A549R和H460R细胞的克隆形成存活率下降，并且与照射后的野生型细胞相比，细胞凋亡率及G₂/M期阻滞增加。

综上所述，本研究初步证实了ITGAV在非小细胞肺癌放射抵抗中的作用，但ITGAV介导非小细胞肺癌放射抵抗的具体分子机制尚未阐明，今后，我们将在本研究的基础上，进一步探究整合素ITGAV及其他成员在肺癌细胞中的表达情况及发生、发展的机制，为解决临床NSCLC放疗抵抗问题提供有利线索和可靠依据。

作者贡献：

唐园惠：实验实施、论文写作

朱圣明、柴晶晶：提供实验技术和写作指导及资金支持

韩佳慧、田超：实验实施

邓鑫州、段奇文：实验设计、提供实验平台及论文写作指导