0 引言

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，据2020年报道全球年新发病例60.4万，死亡病例34.2万，严重威胁着妇女健康^[1]。高危人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌的主要病因，病毒主要通过E6和E7蛋白，引起上皮内瘤变及癌症的发生^[2]。对于晚期及复发性宫颈癌，其主要治疗包括同步放化，但生存期较短，效果不佳，成为宫颈癌治疗中的难点和重点。近年免疫治疗取得了飞速发展，对于较晚期的癌症患者，免疫治疗可显著延长患者的总生存期和无病生存期^[3]。

宫颈癌免疫疗法主要包括免疫检查点抑制剂、治疗性疫苗及过继性T细胞免疫疗法等^[4]，但由于免疫治疗的耐药性，部分患者无法从免疫治疗中获益。据报道，PD-1抗体治疗宫颈癌的反应率仅在20%左右^[5]。因此，探索宫颈癌患者免疫治疗反应（和耐药性）机制，发现新的预测和（或）预后生物标志物，对改善宫颈癌患者的预后有重要意义，在此，我们回顾了免疫治疗相关的耐药机制并作一总结。

1 免疫耐药外在因素 1.1 免疫微环境失调

免疫微环境失调可产生免疫抑制性物质，其中包括免疫抑制细胞、免疫抑制细胞因子、免疫抑制代谢物等，在临床前模型中已被证明影响肿瘤ICI疗效的免疫抑制细胞类型包括Treg细胞、骨髓来源的抑制性细胞（MDSC）、CD4+ Th2细胞和M2极化肿瘤相关巨噬细胞（TAM），这些细胞类型主要通过释放细胞因子、趋化因子和其他可溶性介质，单独或联合促进免疫抑制性肿瘤微环境（TME），防止抗肿瘤细胞毒性和Th1导向的T细胞活性^[6]。有研究表明，与正常的淋巴结相比，肿瘤引流淋巴结中可见免疫抑制性微环境，CD4和CD8阳性Tregs数量更多，免疫抑制细胞因子IL-6、IL-10和TNFα水平较高，PD-L1和B7-H4（一种联合抑制分子）表达增加^[7]。相反，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）增多预示着较高的生存率^[6]，研究证实正常宫颈TILs含量较低，CIN中TILs含量较高，且随着CIN分级的增加，TILs含量呈升高趋势^[8]。已有研究发现MDSC的积累对于宫颈癌和许多其他癌症，可能引起有效的全身免疫抑制，这些骨髓细胞对抗原呈递细胞和CD8⁺T细胞具有有效的免疫抑制活性，从而产生强大且功能齐全的抗肿瘤免疫反应^[9-10]。肿瘤诱导MDSC的全身扩张建立了针对有效肿瘤免疫的第一道防线，这可能解释了免疫治疗在特定患者中失败的原因^[11]。一项Ⅰ期DURVIT研究正在开展，目的是评估对宫颈癌患者瘤内注射杜伐单抗（Medi4736）安全性及肿瘤和免疫微环境的影响^[12]。

1.2 T细胞表观遗传学改变

细胞毒性T细胞（CTL）是肿瘤发展的关键障碍，因此，逃避这种监测是肿瘤发生及免疫耐药的一个共同途径。有研究发现可能是肿瘤微环境中T细胞功能障碍/耗竭的原因，T细胞衰竭状态是预先暴露的T细胞由于持续暴露于相似抗原，导致T细胞的效应机制下降引起^[13]，Medema等^[14]发现肿瘤可以采用独特的抗凋亡机制来防止通过穿孔素（GrBgranzyme B）途径的CTL依赖性细胞毒性。该机制涉及PI-9/SPI-6，这是一种特异性灭活GrB的酶，从而防止穿孔素依赖性细胞凋亡。SPI-6的表达与肿瘤细胞的耐药性有因果关系，过度表达SPI-6会使肿瘤细胞对CTL诱导的杀伤耐药。

1.3 免疫抑制信号代偿性增多

最近研究发现替代性共同抑制性免疫检查点（如CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT和VISTA）的表达与免疫治疗耐药有关^[15]，对宫颈癌的外周血T细胞分析发现，免疫球蛋白和含黏蛋白结构域的分子3（TIM-3）与PD-1在TIL细胞上共表达，且与T细胞衰竭相关^[16]，TIM-3的高表达与宫颈癌预后正相关，这可能是由于肿瘤组织中免疫反应的激活^[17]。淋巴细胞激活基因3（LAG-3）的上调已见于包括宫颈癌在内的多种癌症，可通过抑制细胞毒性T细胞功能并促进Treg免疫抑制，在免疫耐药中发挥作用^[18]，临床前模型已证明肿瘤对抗LAG3抗体的特异性免疫反应增加^[19]。T细胞免疫球蛋白和TIIM结构域（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain, TIGIT）是一种新近发现的抑制性受体，TIGIT在限制肿瘤的适应性免疫方面起着关键作用^[20]。TIGIT与配体CD155和CD112结合，对T细胞反应施加抑制剂信号。在宫颈癌中，已知与其他免疫检查点共表达^[21]。目前一项针对1~2线化疗后晚期宫颈癌患者中单独使用atezolizumab和与抗TGIT tiragolumab联合使用（NCT04300647）的临床试验正在进行。

1.4 免疫调节酶失调

肿瘤面对免疫治疗的适应性反应具有复杂性，不仅包括免疫检查点分子，还包括免疫调节酶。最近一种代谢酶吲哚胺双加氧酶-2, 3（indoleamine dioxygenase 2, 3, IDO）因其具有免疫调节作用引起了关注，IDO是参与犬尿氨酸途径的关键细胞内酶，它通过消耗淋巴细胞存活所必需的色氨酸和产生有毒代谢物来降低细胞毒性T细胞浸润，从而发挥免疫抑制作用^[22]，其在肿瘤-基质界面和淋巴细胞浸润区域表达增强^[23]，IDO诱导肿瘤免疫逃逸的适应性机制类似于PD-L1^[24]。IDO和PD-L1的共表达已经在其他肿瘤类型中得到证明并强调了双重抑制作用。然而，IDO、PD-L1在宫颈和外阴肿瘤中的表达研究较少，研究IDO单药和联合疗法的临床试验也未考虑IDO生物标志物的表达。早期证据表明，抗IDO治疗与抗PD-1/PD-L1联合用于包括宫颈鳞状细胞癌（SCC）在内的多种肿瘤类型^[25]。然而，这些试验的纳入标准中尚未考虑IDO表达，并且IDO与PD-L1在宫颈癌中共表达之间的关系尚未确定。

2 免疫治疗耐药内在因素 2.1 关键基因或表观遗传突变

2.1.1 PIK3CA突变

一项前瞻性研究报告了40%的初发宫颈癌患者出现了PIK3CA突变^[26]，且该突变与较短的PFS显著相关。PI3K/AKT/mTOR抑制剂具有免疫调节特性，因为它们可以通过减少免疫抑制细胞因子和趋化因子的表达以及抑制免疫调节细胞（如调节性T细胞或髓系抑制细胞）的效应功能来增强肿瘤免疫监视^[27]。在小鼠肿瘤模型中，PI3K抑制剂已被证明可以抵消对免疫检查点阻滞的耐药性^[28]。一项正在进行的Ⅰ期试验拟探讨AKT抑制剂AZD5363与durvalumab和olaparib联合治疗存在PIK3-AKT通路突变的难治性实体器官恶性肿瘤的疗效（NCT03772561）。

2.1.2 PTEN缺失

研究发现PTEN缺失的荷瘤小鼠在使用nivolumab或pembrolizumab治疗后，其肿瘤减小效果较差。PTEN的缺失与CCL2和VEGF水平升高，T细胞浸润减少以及对PD-1阻断的耐药性有关^[29]，最近研究报道了在对PD-1阻断治疗高反应的宫颈癌患者的病灶中发现了等位基因PTEN丢失，提示PTEN缺失与宫颈癌患者抗PD-1治疗反应存在关联^[30]。

2.1.3 VEGF

血管内皮生长因子（VEGF）与体内免疫抑制性微环境有关，VEGF可能通过以下机制发挥免疫抑制作用^[31]：影响树突状细胞的成熟、导致抑制性Tregs和肿瘤相关巨噬细胞数量的增加、减少血管内皮细胞中ICAM-1和VCAM-1及肿瘤内皮FasL的表达、与肿瘤血管的“正常化”和CD8⁺T细胞反应有关等，因此，VEGF可作为对免疫检查点抑制剂疗法反应的一个潜在生物标志物。卡姆瑞珠单抗联合阿帕替尼的Ⅱ期试验（CLAP研究）结果显示，抗PD-1治疗联合阿帕替尼组晚期宫颈癌患者的ORR提高至55.6%^[32]。正在进行的Ⅲ期试验（BEATcc研究）的主要目的是确定在转移性、复发性或持续性宫颈癌患者中采用顺铂-紫杉醇和贝伐珠单抗中加用阿替利珠单抗治疗是否可提高总生存期^[33]。

2.1.4 NANOG

NANOG信号转导与肿瘤细胞的免疫耐药形成有关。细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的免疫选择导致具有高表达Nanog同胚盒（NANOG）的细胞亚群富集，这些NANOG细胞表现出干细胞样和抗凋亡特性，并且通过AKT信号通路的过度激活对CTL杀伤具有抗性^[34]，Kim等^[35]研究发现高度免疫抵抗的宫颈癌细胞系出现NANOG的富集，其通过转录调控优先表达LC3B，LC3B通过EGFR-AKT功能轴的过度活化促进免疫耐药性和CSC样表型。Song等^[36]研究发现HDAC1有助于抑制NANOG介导的CDKN2D和CDKN1B基因表达，以获得茎状特性，并且HDAC1是抑制NANOG介导TRIM17和NOXA基因所必需的，导致抗凋亡MCL-1的上调，从而赋予免疫抵抗能力。

2.1.5 MHCⅠ类表达缺失

免疫治疗的成功可能取决于细胞毒性CD8⁺T细胞的功能性肿瘤抗原呈递机制的存在，这需要MHCⅠ类分子参与。如果MHCⅠ类分子表达缺失，肿瘤将停止展示抗原，从而导致不能被细胞毒性T细胞靶向消灭。因此，在没有MHCⅠ类的情况下，通过靶向PD-1/PD-L1或其他免疫抑制途径来促进肿瘤对细胞毒性T细胞反应可能无效^[37]。有研究发现MHCⅠ类分子缺失和PD-L1表达在宫颈侵袭性肿瘤与原位癌中明显增加，并且PD-L1阳性SCC中显示MHCⅠ类分子表达的克隆或完全丧失。这些研究表明，MHCⅠ类分子可能是影响抗PD-1检查点抑制剂疗效的重要障碍^[38]。β2-微球蛋白突变可下调肿瘤细胞或抗原递呈细胞的MHC分子表达，抗原呈递途径的破坏是肿瘤产生免疫治疗抵抗的因素之一^[39]。Rassy等^[40]发现宫颈癌免疫抑制剂耐药相关的β2-微球蛋白突变率为2.9%，提示该突变可能与免疫治疗耐药有关，但涉及的研究较少。

2.1.6 X连锁淋巴细胞调节蛋白pM1（XLR）及其同系物

研究发现XLR及其同系物使肿瘤细胞对CTL杀伤作用出现抗性，可能通过Akt的激活，导致抗凋亡蛋白的上调，从而导致免疫抗性表型^{[18, 41]}。

2.1.7 JAK/STAT通路

JAK/STAT通路参与免疫激活和调节过程，包括那些参与肿瘤细胞识别和肿瘤驱动的免疫逃逸过程。STAT1、STAT4和STAT5可刺激NK细胞的成熟、增殖和细胞毒性，然而，JAK/STAT蛋白的过度激活与肿瘤治疗耐受性有关，这与Treg调节功能的基因增加相关^[42]。研究发现HPV阳性宫颈癌细胞能够产生大量IL-6，用于自分泌信号转导和增加STAT激活，促进了癌症的发展及免疫逃逸^[43]，但不同JAK/STAT通路的抑制剂在体内试验中可能会产生意想不到的结果，因为不同靶点对于肿瘤细胞的刺激作用不同，因此还需要找到可以影响肿瘤细胞并促进免疫系统激活的靶点。

2.2 肿瘤代谢异常

新的数据表明，在局部晚期宫颈癌患者中，ADP-核糖聚合酶PAR水平与CD8⁺T细胞浸润负相关，而维生素B6激活酶吡哆醛激酶PDXK水平与DC-LAMP细胞浸润程度正相关，提示癌细胞的代谢水平改变与免疫浸润相关，可能是肿瘤免疫逃逸及对抗免疫治疗的策略之一^[44]。

3 解决方案及未来进展

由于免疫调节机制的复杂性和恶性肿瘤的异质性，不管是免疫检查点抑制剂，还是治疗性疫苗等，在长期刺激下，肿瘤细胞和免疫微环境通过以上各种途径去逃避免疫效应，从而保持肿瘤长期存活及进展，因此迫切需要找到克服免疫治疗无应答来提高免疫治疗效果，到目前为止，已探索出多种治疗方式以克服耐药难关，包括通过减少肿瘤负担和增加肿瘤免疫原性（如与化疗、放疗和靶向治疗相结合）；用表观遗传学重编程、阻断其他新型免疫检查点、更强效的T细胞免疫疗法及靶向HPV相关蛋白的疫苗等增强T细胞反应；也可通过靶向宫颈癌细胞产生的免疫抑制和癌症促进因子，特异性抑制免疫细胞并限制某些免疫抑制代谢物和基质分子逆转免疫抑制环境，防止肿瘤进一步生长，从而获得更强和更持续的临床反应。

3.1 联合用药

免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）作为单药治疗可能有助于重新激活抗肿瘤T细胞免疫力并改善衰竭状态，而化疗、靶向和放射介导的治疗可以促进抗原性，改善IFN信号转导和肿瘤内浸润，并增加PD-1/PD-L1的表达。ICB与这些模式中的任何一种组合将潜在地增强DC的功能和抗原呈递，减少免疫抑制环境的消耗，增强CD4和CD8⁺T细胞肿瘤反应性的多样性和稳健性以及潜在的全身免疫力，共同导致免疫肿瘤控制的显著改善^[45]。

3.1.1 联合放疗

放疗可影响免疫细胞的功能，包括提高CD8⁺T细胞对肿瘤细胞杀伤作用，引起树突状细胞迁移，肿瘤抗原交叉渗透，导致T细胞活化和增殖等。此外，放疗可能通过肿瘤脉管系统和趋化因子激活肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的外渗来增加TIL的密度^[46]。在宫颈癌中，免疫疗法与放射治疗相结合的相关数据较少。有研究发现抗CTLA-4在放疗前给药，与放疗后给药相比，疗效更高，可能是提前阻断抑制信号后，使肿瘤更好暴露于放疗的细胞毒性作用中而提高疗效。同时放疗可增加PD-L1表达，这可能作为防止T细胞介导的肿瘤排斥反应的负反馈机制^[47]。近来一项Ⅰ期试验将PD-L1阻断与宫颈癌放化疗进行联合治疗，有可能改变局部晚期淋巴结阳性宫颈癌的治疗格局，并将为最佳测序和CRT免疫治疗的使用提供新的见解^[48]。

3.1.2 联合化疗

化疗可以通过调节肿瘤微环境（TME）中存在的免疫细胞来诱导抗肿瘤免疫，这已经在宫颈癌中得到证实。Meng等^[49]发现既往接受过手术前新辅助化疗（NACT）的宫颈癌患者CD8⁺T细胞数、PD-L1和PD-1检查点表达均较高。Heeren等^[50]发现与顺铂单药治疗相比，顺铂和紫杉醇协同作用的新辅助治疗更有效地增强细胞毒性T细胞调节，Ramos等^[51]进行了化疗与免疫疗法相结合的临床试验，结果表明，吉西他滨和DNA疫苗（pgDE7h）可增强抗肿瘤反应，所有经过联合治疗的HPV阳性的宫颈癌模型小鼠都表现出强烈的免疫反应诱导和肿瘤消除，并且在观察期结束时保持无瘤生存。

3.1.3 双检查点抑制

为提高宫颈癌免疫治疗效果，双免疫检查点抑制剂也是一个可行的组合，如一类CTLA-4抗体可激活T细胞启动和清除抑制性调节细胞；另一类，PD-1/PD-L1抑制剂可增强外周T细胞的活化，并有助于抵消适应性耐药。这两种类型的检查点抑制剂相互交叉，可能导致协同效应。在黑色素瘤研究中，已证明PD-1和CTLA-4抑制剂联合使用，可使反应率提高两倍。患者生存率也更高。FDA批准这两种抑制剂为许多其他癌症中的双ICB打开了大门^[52]。但不能忽略两者叠加的不良反应，这需要继续考量和探索。针对宫颈癌双免疫检查点抑制的多项临床试验正在进行中（NCT01975831、NCT02488759、NCT02834013和NCT02658890）。

3.1.4 联合疫苗

疫苗接种可提高免疫检查点抑制剂的疗效：研究发现^[53]给小鼠接种E6/E7肽疫苗后，PD-L1表达上调导致免疫抑制，当应用PD-1阻断时，观察到有效的肿瘤消退，还发现两者联合治疗后，小鼠的肿瘤免疫微环境比单独使用疫苗的抑制性要小得多，浸润性CD8⁺T细胞增加，Treg细胞较少，可能是该组合可改善抗原呈递，增加TILs密度，还耗尽了抑制性调节细胞，从而表现出显著的免疫杀伤作用，最近一项Ⅱ期试验的数据说明HPV肽疫苗与纳武单抗的组合得到的ORR为33%，大约是抗PD-1单药治疗的两倍^[54]。这一新的临床证据鼓舞了人们的信心。

3.2 新型疫苗

目前大量的宫颈癌免疫治疗疫苗大多是针对HPV早期蛋白质，主要是E6和（或）E7。疫苗类型包括活载体、蛋白质/肽、核酸和基于DC细胞的疫苗。这些抗原特异性形式的免疫治疗旨在通过MHCⅠ类和Ⅱ类刺激抗原呈递，从而导致CD8⁺细胞毒性和CD4⁺辅助性T细胞反应的产生。但治疗性疫苗的一个关键考虑因素是它们对完整免疫系统的依赖，这在免疫抑制患者中可能存在问题，而且这些患者患HPV相关癌症的风险也较高。因此新型疫苗一部分也致力于减轻这种担忧，目前已出现有缺陷的/单轮感染载体可在一定程度上减少免疫抑制患者对疫苗的不良反应^[55]。也陆续尝试用不同类型的免疫治疗疫苗进行加强疫苗接种。这种组合策略可能比单独使用任何一种疫苗引发更强的免疫反应^[56]。目前，临床试验正在研究将DNA疫苗与TA-CIN融合蛋白疫苗联合用于HPV16+的策略，其异常细胞学检查低于高级别病变（ASC-US/LSIL、NCT03911076和NCT03913117）。

3.3 新型免疫靶点或药物

免疫治疗耐药涉及多种作用机制，针对关键靶点或程序的治疗药物也是推成出新，旨在提高抗肿瘤的治疗效果。一些增强肿瘤微环境中效应免疫细胞的激动性抗体如OX40、GITR和TLR3等已被探索用于治疗宫颈癌，尽管尚未批准此类治疗用于宫颈癌。OX40由活化的免疫细胞表达，其可以促进T细胞活化为效应T细胞^[57]。在实体瘤患者（包括HPV阳性和阴性宫颈癌患者）中OX40激动剂的临床试验的早期结果发现，瘤体内Ki67+CD4和CD8+T细胞群增加，OX40+FOXP3+Treg群体减少60%^[58]，免疫细胞在HPV阳性人宫颈组织样品中增强GITR的表达表明GITR可以作为疾病进展生物标志物^[59]，GITR激动剂可以通过激活CD25、IL-2和IFNγ来增强效应T细胞，并抑制抑制性Treg功能。一些非宫颈癌临床前模型也证明了GITR免疫疗法的潜在益处^[60]。

除PD-1和CTLA-4外，其他用于治疗宫颈癌的治疗性抗体也在积极研究中。比如新型免疫检查点TIM-3、LAG-3和VISTA等，此外还有一些免疫微环境抑制因子拮抗剂如CD39、A2AR也逐渐受到重视。CD39/CD73和A2AR分子密切相关，跨膜CD39促进腺苷的产生，这反过来又发出A2AR下调免疫系统功能的信号。因此，抑制该途径中的一个步骤可以增强T细胞的功能。目前抗CD39免疫疗法仍在开发中，临床试验已开始探索其在抗肿瘤免疫中的应用^[61]。此外随着对ICIs反应相关的基因组和微环境过程理解的不断提高，寻找可以预测免疫治疗效果的生物标志物，相应地分离应答者和无应答者来支持患者的选择和决策，实现了精准治疗的目的，有研究发现，PARP1表达水平与免疫治疗相关特征的状态相关，因此它可能成为预测肿瘤ICI反应的有希望的生物标志物^[62]。

3.4 基因编辑

利用CRISPR Cas9（clustered regularly interspaced palindromic repeats associated protein 9）基因敲除技术进行基因编辑技术日渐成熟，并逐步从科研服务于临床实践，转录激活剂样效应核酸酶（transcription activator-Like effector nucleases, TALENs）也可用作基因编辑工具进行靶向性基因敲除，在体外观察到靶向E7癌蛋白的TALEN可下调E7表达并导致细胞死亡^[63]。对宫颈上皮内瘤变（CIN）患者的Ⅰ期研究将评估TALEN-HPV E6/E7和CRISPR/Cas9-HPV E6/E7治疗的安全性和有效性（NCT 03057912）。

4 小结

综上所述，免疫治疗随之而来的免疫耐药成为了治疗的一大障碍，本文从肿瘤内在因素，如关键基因或表观遗传突变、肿瘤自身代谢异常等使肿瘤细胞产生自我防御免疫治疗的攻击和外在因素，包括免疫微环境失调、T细胞表观遗传学改变、免疫抑制信号代偿性增多等两个方面介绍了免疫治疗耐药的相关机制。两者共同导致了宫颈癌免疫耐药，人们也不停寻找和解决耐药的良方，包括联合用药及寻找更有效的免疫靶点或研制新型药物，从而获得更强和更持续的临床反应。

作者贡献：

杨钧媛：论文撰写及参考文献整理

蔡红兵：论文构思及撰写