肿瘤防治研究  2022, Vol. 49 Issue (11): 1134-1138
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管,湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
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文章信息

金复康调控免疫衰老抑制肺癌转移
Jinfukang Inhibits Lung Cancer Metastasis by Regulating Immune Senescence
肿瘤防治研究, 2022, 49(11): 1134-1138
Cancer Research on Prevention and Treatment, 2022, 49(11): 1134-1138
http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1474
收稿日期: 2021-12-17
修回日期: 2022-04-11
金复康调控免疫衰老抑制肺癌转移
姚望1 ,    阙祖俊2 ,    姚嘉良2 ,    于盼2 ,    罗斌1 ,    田建辉1,2     
1. 200032 上海,上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科;
2. 200071 上海,上海中医药大学附属市中医医院肿瘤临床医学中心
摘要: 目的 探讨免疫衰老对肺癌转移的影响,并揭示扶正中药金复康防治肺癌转移的作用机制。方法 不同月龄C57BL/6小鼠尾静脉注射Lewis肺癌细胞建立肺移植瘤模型;其中6月龄组小鼠采用金复康连续灌胃42天;观察小鼠肺部肿瘤转移情况;流式细胞术检测小鼠外周血中记忆T细胞、NK细胞比例的变化。结果 15月龄和6月龄小鼠较2月龄小鼠肺转移成瘤率显著上升(均P < 0.05)。外周血记忆CD4+T细胞丰度与小鼠年龄呈正相关(2月龄 vs. 6月龄,P=0.041;2月龄 vs. 15月龄,P=0.041)。NK细胞丰度与年龄呈负相关(2月 vs. 6月,P=0.009;2月 vs. 15月,P=0.009)。金复康给药组小鼠的生存期较0.9%NaCl组有延长趋势,但差异无统计学意义,而给药组外周血NK细胞水平较0.9%NaCl组显著升高(P=0.029)。结论 免疫衰老可促进肺癌转移发生,金复康延长小鼠生存期可能与延缓免疫衰老和改善NK细胞水平有关。
关键词: 免疫衰老    肺癌    转移    NK细胞    
Jinfukang Inhibits Lung Cancer Metastasis by Regulating Immune Senescence
YAO Wang1 , QUE Zujun2 , YAO Jialiang2 , YU Pan2 , LUO Bin1 , TIAN Jianhui1,2     
1. Department of Oncology, Longhua Hospital Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China;
2. Research Center for Cancer, Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200071, China
Abstract: Objective To explore the effect of immune senescence on lung cancer metastasis and reveal the mechanism of Fuzheng traditional Chinese medicine Jinfukang in the prevention and treatment of the metastasis. Methods A lung metastasis model of Lewis lung cancer cells was established in C57BL/6 mice with different ages (15 months, 6 months, and 2 months). Mice in the 6-month-old group were given Jinfukang intragastrically for 42 days. Pulmonary metastasis was analyzed by in vivo imaging, anatomical microscopic observation, and HE staining. The proportion of memory T cells and NK cells in peripheral blood was detected by flow cytometry. Results The lung metastatic tumor formation rate of 15-month-old and 6-month-old mice was significantly higher than that of 2-month-old mice (all P < 0.05). Abundance of CD4+T cells in peripheral blood was positively correlated with age (2-month-old vs. 6-month-old, P=0.041; 2-month-old vs.15-month-old, P=0.041; 6-month-old vs.15-month-old, P=0.953). The abundance of NK cells was negatively correlated with age (2-month-old vs. 6-month-old, P=0.009; 2-month-old vs.15-month-old, P=0.009; 6-month-old vs. 15-month-old, P=0.574). However, the survival time of mice in the Jinfukang group was longer (P > 0.05) and the level of NK cells in peripheral blood was significantly higher (P=0.029) than those in the normal saline group. Conclusion Immune senescence can promote the metastasis of lung cancer. The prolongation of the survival time of mice administered with Jinfukang may be related to delaying immune senescence and increasing the number of NK cells.
Key words: Immune senescence    Lung cancer    Metastasis    NK cell    
0 引言

根据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)发布的报告显示,癌症是全世界的一个主要死因,2020年近1 000万例(近六分之一)死亡由癌症导致,其中肺癌患者所占比例最高。虽然近年来恶性肿瘤总体死亡率较前下降,但肺癌造成的死亡人数仍高居所有恶性肿瘤之首[1]

流行病学研究显示,肺癌的发生与人口老龄化水平关系密切[2-4],衰老可能是导致肺癌发病率上升的原因[5]。目前大部分研究都关注免疫衰老与肿瘤发病的关系,但与肿瘤转移的联系仍不明确。

田建辉教授针对肺癌转移的亚临床阶段提出“正虚伏毒”是肺癌发病和转移的核心病机[6],其中“正虚”主要指人体增龄性免疫衰老及其诱导的免疫监视功能下降和免疫逃逸、神经-内分泌-免疫网络功能紊乱等,导致人体全身抗癌能力下降,该学说核心论文获得2019年第四届科协优秀论文遴选计划[7]。本研究从免疫衰老介导外周免疫抑制角度揭示“正虚伏毒”的生物学基础,探索免疫衰老与肺癌转移的关系,并进一步验证扶正中药金复康口服液通过调控免疫衰老防治肺癌转移的作用机制。

1 材料与方法 1.1 细胞株及动物

采用小鼠肺腺癌Lewis细胞结合荧光素酶构建2LL-luc-GFP细胞株(由上海中医药大学朱诗国教授赠予)。近交系C57BL/6小鼠购自杭州子源实验动物科技有限公司[许可证号为SCXK(浙)2019-0004],雄性,15月龄30只;6月龄50只;2月龄30只。饲养于上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心,饲养环境为无特殊病原体级屏障系统。环境参数为温度(22±2)℃,相对湿度(55±10)%,12 h昼夜交替。小鼠自由摄食和饮水,造模前适应性喂养1周。本实验经上海中医药大学附属龙华医院实验动物福利与伦理委员会审核。

1.2 药物和试剂

FITC Anti-Mo CD3抗体(批号100204,美国Biolegend公司)。APC Anti-Mo NK1.1抗体(批号108710,美国Biolegend公司)。PE/Cy7 Anti-Mo CD62L抗体(批号B269976,美国Biolegend公司)。PE Anti-Mo CD196抗体(批号B309195,美国Biolegend公司)。PE Anti-Mo CD4抗体(批号1923424,美国Invitrogen公司)。PerCP-Cy5.5 Anti-Hu/Mo CD44抗体(批号2142979,美国Invitrogen公司)。红细胞裂解液(批号6208846,美国BD公司)。1%盐酸酒精溶液、苏木精染液、伊红染液均购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3 仪器

MCO-18AIC型CO2恒温培养箱(日本SANYO公司),5430R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司),DMI3000B型荧光倒置显微镜(德国Leica公司),分析型流式细胞仪(FACSVerse flow cytometer,美国BD公司)。

1.4 细胞培养

取培养基DMEM,加10%胎牛血清、1%双抗(100 u/ml青霉素及100 μg/ml链霉素),将消化后的2LL细胞与配置好的培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.5 小鼠分组

将所有小鼠按照年龄分为15月龄、6月龄、2月龄三组,每组各30只,适应性饲养一周后造模。余下20只6月龄小鼠按照体质量分为10个等级,采用随机数字法将同一质量等级的2只小鼠分为0.9%NaCl组和金复康口服液组,避免小鼠体质量差异对实验结果的影响。适应性饲养一周后开始给药,两周后造模。

1.6 构建小鼠肺癌移植瘤模型

将对数生长期的2LL-luc-GFP细胞消化离心后,用0.9%NaCl重悬,调整细胞密度为2×106个/毫升。将小鼠用固定器固定后,小鼠尾静脉注射0.1 ml细胞悬液。

1.7 小鼠给药方法

将0.9%NaCl组和金复康给药组小鼠适应性饲养一周后,开始灌胃给药。金复康给药组每次灌胃0.2 ml金复康口服液流浸膏(批号:20200704),连续灌胃42天;0.9%NaCl组每次灌胃等剂量的0.9%NaCl。

1.8 观察指标及方法

1.8.1 活体成像法

对小鼠腹腔注射荧光素酶底物,浓度为15 mg/ml,注射量10 μl/g,10 min后置入麻醉机,以异氟烷吸入麻醉5 min,再放入活体荧光成像仪,进行图像拍摄。观察小鼠肺转移成瘤情况。

1.8.2 小鼠肺HE染色法

完整分离小鼠的双肺标本,组织标本用0.9%NaCl清洗后,4%多聚甲醛溶液固定,常规脱水、透明和浸蜡,进行石蜡包埋,切成3.5 μm厚度的切片,HE染色后,用中性树胶封片。根据HE染色结果判定小鼠肺转移发生情况。

1.8.3 流式细胞术检测小鼠外周血免疫细胞

洁净流式上样管取100 μl小鼠外周血,加入5 μl的BSA封闭5 min。再加入相应抗CD3、CD4、CD44、CD62L、CD196、NK1.1抗体,避光孵育20 min后,加入红细胞裂解液,裂解8 min,当上样管细胞悬液澄清时,1 400 r/min离心4 min,弃上清液,加入2 ml PBS重悬清洗,1 400 r/min离心4 min,重复清洗2次后,弃上清液,加入300 μl NS重悬,流式细胞仪检测。

1.9 统计学方法

采用SPSS24.0软件进行数据分析。计量资料以(x±s)表示。两组间比较采用独立样本T检验。多组比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验。计数资料使用卡方检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 衰老对小鼠肺癌转移的影响

通过小鼠尾静脉注射小鼠肺癌细胞造模后第4周对小鼠进行活体成像分析,结合取材小鼠肺部组织HE染色结果进行统计,结果显示,15月龄小鼠较2月龄小鼠肺部转移瘤成瘤率明显上升,差异有统计学意义(P=0.005),6月龄小鼠较2月龄小鼠肺转移瘤成瘤率差异也具有统计学意义(P=0.03),15月龄小鼠与6月龄小鼠肺转移瘤成瘤率有差异趋势,但不具有统计学意义(P=0.472),提示衰老小鼠更容易发生肺转移,见图 1

图 1 小鼠转移瘤活体成像和HE染色结果 Figure 1 In vivo imaging of metastatic tumor in mice and HE staining results
2.2 金复康口服液对小鼠生存率的影响

对实验小鼠生存时间行Cox分析,结果显示造模后第9天0.9%NaCl组小鼠开始出现死亡,截至造模后49天,金复康组小鼠死亡3只,0.9%NaCl组死亡5只,但差异无统计学意义(P=0.230),见图 2

图 2 造模后衰老小鼠累积生存率 Figure 2 Cumulative survival ratio of aging mice after modeling
2.3 金复康抗免疫衰老作用

对肺癌转移及金复康口服液灌胃两次实验小鼠取材的外周血进行流式细胞术检测,结果显示,衰老小鼠外周血记忆CD4+T细胞出现与免疫衰老相关的比例升高,差异有统计学意义(2月龄 vs. 6月龄,P=0.041;2月龄 vs. 15月龄,P=0.041),6月龄与15月龄间差异无统计学意义(P=0.953),其余记忆效应T细胞未出现显著免疫衰老表型,差异无统计学意义(P > 0.05),见图 3

图 3 流式细胞术检测小鼠外周血记忆T细胞亚群比例 Figure 3 Flow cytometry results for memory T cells subset percentage in peripheral blood of mice

各年龄组小鼠的NK细胞比例随着小鼠年龄的上升而下降,差异有统计学意义(2月龄 vs. 15月龄,P < 0.001;6月龄 vs. 15月龄,P=0.001),出现免疫抑制的免疫衰老表征,2月龄与6月龄间差异无统计学意义(P=0.203)。而金复康口服液灌胃组小鼠较0.9%NaCl组小鼠外周血NK细胞比例升高,差异有统计学意义(P=0.029)。说明金复康口服液具有调控小鼠外周血NK细胞比例,抗免疫衰老作用,见图 4

图 4 流式细胞术检测小鼠外周血NK细胞比例的统计结果 Figure 4 Flow cytometry results for NK cells percentage in peripheral of mice
3 讨论

免疫衰老是衰老的重要特征,这一概念由Walford在1969年提出,被认为在肿瘤发病过程中起到至关重要的作用[3]。免疫衰老涵盖各级免疫器官与各种免疫细胞的衰老变化,临床表现为老年人的抗感染能力降低、疫苗反应减弱、自身免疫性疾病增多、慢性炎性反应持续和恶性肿瘤发病率上升等[8]。而衰老会导致肠道菌群失调、促炎因子分泌增加、氧化应激产生而引起慢性炎性反应状态,促进免疫衰老,造成免疫监视减弱,促进免疫逃逸。研究显示,增龄与肠道菌群多样化呈负相关[9],衰老的肠道菌群降低了树突状细胞对肿瘤特异性CD8+T细胞的诱导,并增强肿瘤病灶中髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)和调节性T细胞的浸润[10]。衰老同样导致促炎因子TNF-α和IL-6水平增加,导致单核-巨噬细胞活化,进而产生老年人慢性炎性反应状态[11]。活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平则与衰老呈正相关,肠道菌群作用机制可能与NADPH氧化酶Nox被激活有关[12]。ROS会通过直接攻击附近的线粒体膜和线粒体DNA,导致线粒体功能障碍和更多的ROS产生,引起氧化应激,同样导致肿瘤的发生[13]

本课题组前期研究发现,健康人群随着年龄增高出现典型的免疫衰老,初始T细胞(CD4+CD45RA+)、T细胞总群(CD3+)、细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)、CD4+/CD8+比值降低,调节性T细胞(CD4+CD25+)升高[14-15],促进了外周免疫抑制环境的形成,进而导致循环肿瘤细胞逃逸,引起肿瘤转移的发生。本研究发现,衰老可导致小鼠尾静脉肺移植瘤成瘤率上升,出现记忆CD4+T细胞比例上升和NK细胞比例下降等免疫衰老表征,而NK细胞丰度下降的免疫抑制正是导致肺癌转移的关键[14]。金复康口服液具有抗肺癌转移作用,其作用机制可能与调节外周血NK细胞比例有关。

《医宗必读》说:“积之成也,正气不足,而后邪气踞之”,说明肿瘤的形成是正气不足后邪气内侵所致,正虚是肿瘤发生的前提条件,癌毒是导致肿瘤发生的根本原因。因虚致瘀,或留或积,久居一处而不散,产生的“癥瘕积聚”。这与现代医学认为肿瘤的发生与机体免疫紊乱变化的前提相一致。而田建辉教授认为“正虚伏毒”不但是肿瘤发生,也是肿瘤转移的基本发病机制,在肿瘤转移过程中“正虚”主要指人体增龄性免疫衰老及其诱导的免疫监视功能下降和免疫逃逸的发生,导致全身抗癌能力下降,从而不能制约各种毒邪;而“伏毒”指术后患者体内已经存在发生转化的细胞、肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)和CTC、休眠肿瘤细胞等。本研究从增龄性免疫衰老介导的外周免疫抑制状态出发,验证了衰老小鼠外周血NK细胞减少和记忆CD4+T细胞增多的“正虚”免疫衰老表现,发现并证实衰老对于肺癌转移具有显著促进作用。同时课题组前期临床已验证,扶正中药金复康具有抗肺癌转移发生作用[16],本研究初步探索了其抗肺癌转移作用机制主要通过调节NK细胞比例,揭示了肿瘤转移核心病机“正虚伏毒”的生物学基础和形成机制,丰富了“扶正治癌”的学术思想。

作者贡献:

姚望:实验设计和实施、文章撰写

阙祖俊:实验指导、文章撰写指导

姚嘉良、于盼、罗斌:协助实验设计和实施

田建辉:科学问题提出、实验框架设计、文章撰写指导

参考文献
[1]
Siegel RL, Miller KD, Fuchs HE, et al. Cancer statistics, 2022[J]. CA Cancer J Clin, 2022, 72(1): 7-33. DOI:10.3322/caac.21708
[2]
Fane M, Weeraratna AT. Normal Aging and Its Role in Cancer Metastasis[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2020, 10(9): a037341. DOI:10.1101/cshperspect.a037341
[3]
Palmer S, Albergante L, Blackburn CC, et al. Thymic involution and rising disease incidence with age[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018, 115(8): 1883-1888. DOI:10.1073/pnas.1714478115
[4]
李丹, 刘硕, 周莹, 等. 2007—2016年北京市东城区居民恶性肿瘤发病状况分析[J]. 中国肿瘤, 2020, 29(7): 490-496. [Li D, Liu S, Zhou Y, et al. Cancer Incidence in Dongcheng District of Beijing from 2007 to 2016[J]. Zhongguo Zhong Liu, 2020, 29(7): 490-496.]
[5]
Lian J, Yue Y, Yu W, et al. Immunosenescence: a key player in cancer development[J]. J Hematol Oncol, 2020, 13(1): 151. DOI:10.1186/s13045-020-00986-z
[6]
田建辉. "正虚伏毒"为肺癌发病的核心病机[J]. 上海中医药杂志, 2016, 50(12): 10-14. [Tian JH. Discussion on the core pathogenesis of lung cancer with "deficiency of vital qi and hidden toxin"[J]. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi, 2016, 50(12): 10-14.]
[7]
田建辉, 罗斌, 毕凌, 等. 非小细胞肺癌循环肿瘤细胞表达规律及其与"伏邪"致病关系的研究[J]. 上海中医药杂志, 2016, 50(1): 15-19, 33. [Tian JH, Luo B, Bi L, et al. Expression of circulating tumor cells in NSCLC and its relationship with "Hidden Pathogen"[J]. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi, 2016, 50(1): 15-19, 33.]
[8]
Sadighi Akha AA. Aging and the immune system: An overview[J]. J Immunol Methods, 2018, 463: 21-26. DOI:10.1016/j.jim.2018.08.005
[9]
Kong F, Hua Y, Zeng B, et al. Gut microbiota signatures of longevity[J]. Curr Biol, 2016, 26(18): R832-R833. DOI:10.1016/j.cub.2016.08.015
[10]
Biragyn A, Ferrucci L. Gut dysbiosis: a potential link between increased cancer risk in ageing and inflammaging[J]. Lancet Oncol, 2018, 19(6): e295-e304. DOI:10.1016/S1470-2045(18)30095-0
[11]
Wang GC, Casolaro V. Immunologic changes in frail older adults[J]. Transl Med UniSa, 2014, 9: 1-6.
[12]
Iatsenko I, Boquete JP, Lemaitre B. Microbiota-Derived Lactate Activates Production of Reactive Oxygen Species by the Intestinal NADPH Oxidase Nox and Shortens Drosophila Lifespan[J]. Immunity, 2018, 49(5): 929-942. e5. DOI:10.1016/j.immuni.2018.09.017
[13]
Obrador E, Liu-smith F, Dellinger RW, et al. Oxidative stress and antioxidants in the pathophysiology of malignant melanoma[J]. Biol Chem, 2019, 400(5): 589-612. DOI:10.1515/hsz-2018-0327
[14]
Qin L, Jing X, Qiu Z, et al. Aging of immune system: Immune signature from peripheral blood lymphocyte subsets in 1068 healthy adults[J]. Aging(Albany NY), 2016, 8(5): 848-859.
[15]
董静懿, 宁小晓, 王蕾, 等. 上海地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间调查[J]. 检验医学, 2014, 29(6): 617-621, 627. [Dong JY, Ning XX, Wang L, et al. Investigation on the reference ranges of peripheral blood T lymphocyte subsets among healthy adults in Shanghai[J]. Jian Yan Yi Xue, 2014, 29(6): 617-621, 627.]
[16]
刘嘉湘, 潘敏求, 黎月恒, 等. 金复康口服液治疗原发性非小细胞肺癌临床研究[J]. 肿瘤, 2001, 21(6): 463-465. [Liu JX, Pan MQ, Li YH, et al. Clinical study of Jinfukang oral liquid for treating non-small cell lung cancer[J]. Zhong Liu, 2001, 21(6): 463-465.]