0 引言

前列腺癌（prostate cancer）是全球男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一，是男性第五大癌症死因^[1-2]。据统计，随着人口老龄化的加剧我国50岁及以上年龄前列腺癌的发病率正不断上升^[3]。目前，有关前列腺癌发生发展的分子机制包括：Myc上调、NKX3.1下调、PTEN的突变或缺失、miRNA调节、TMPRSS2-ERG易位以及一些信号通路的失调^[4-6]。

环状RNA是真核生物中共价闭合的内源性生物分子，通过外显子或内含子环化在3’和5’末端连接，形成完整的环状结构，这种特殊的结构赋予其比线性RNA更高的稳定性^[7-10]。研究发现，环状RNA的表达失调与多种癌症发生发展相关，如结直肠癌^[11]、肺癌^[12]、胃癌^[13]、膀胱癌^[14]等。最新研究报道了前列腺癌中广泛和功能性的circRNA^[15-16]。在前期预实验中，我们通过RNA深度测序后，发现hsa_circ_0001922与前列腺癌转移高度相关，然而，目前尚未报道hsa_circ_0001922在前列腺癌中的作用。本研究旨在探索hsa_circ_0001922对前列腺癌PC-3细胞生物学功能的影响以及分子机制，以期为前列腺癌的临床治疗提供新靶标和新思路。

1 材料和方法 1.1 材料

人前列腺癌PC-3细胞株购于ATCC细胞库、人正常前列腺上皮细胞RWPE-1购于中国上海中科院细胞库。RPMI1640培养基、胎牛血清、胰酶、EDGS、Keratinocyte-SFM购于美国Gibco公司；qRT-PCR引物购于武汉赛维尔公司；反转录试剂盒与实时荧光定量PCR试剂盒均购于日本TaKaRa公司；RNAFISH试剂盒、探针及siRNA购于广州锐博公司；Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司；Transwell小室购于美国Millipore公司；基质胶购自美国BD公司；BCA全蛋白提取试剂盒购于中国索莱宝公司；Western blot抗体购于中国Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

PC-3细胞为贴壁细胞，用含10%FBS的RPMI1640培养基进行常规培养，待细胞生长到80%，用0.25%胰酶进行传代用于后续研究。RWPE-1细胞用特殊培养基（EDGS 5 ml和Keratinocyte-SFM 500 ml混匀）进行培养，待细胞生长至80%，用0.05%胰酶进行传代用于后续研究。

1.2.2 荧光实时定量（qRT-PCR）

采用TRIzol法提取细胞总RNA，按反转录试剂盒与实时荧光定量PCR试剂盒操作，以GAPDH为内参基因，以2-ΔΔCt法对结果进行分析。引物序列见表 1。

1.2.3 RNA FISH实验

使用Ribo Fluorescent In Situ Hybridzation Kit试剂盒。细胞培养：将细胞爬片置于24孔板底，培养适量细胞，实验前使细胞融合度达到60%~70%，注意爬片与底板间不要产生气泡。细胞固定和通透：PBS清洗细胞5 min，4%多聚甲醛室温固定10 min后PBS清洗细胞5 min，共3次；每孔加入1 ml预冷的通透液（含0.5%Triton X-100的PBS），4℃静置5 min，弃去通透液后，加入PBS清洗细胞5 min，3次。探针检测：每孔加入200 μl预杂交液，37℃封闭30 min，将杂交液在37℃中预热，避光条件下，将2.5 μl 20 μmol/L探针加入到100 μl杂交液中，弃去预杂交液，加入100 μl含有探针的探针杂交液，避光，37℃杂交过夜，避光，42℃，杂交液1（4×SSC，0.1%Tween-20）清洗细胞3次，每次5 min，以降低背景信号，避光，42℃；杂交液2（2×SSC）清洗细胞1次，避光，42℃；杂交液3（1×SSC）清洗细胞1次，避光，PBS清洗细胞，室温5 min；DNA染色：避光，1×DAPI染色液染色10 min，避光下PBS清洗细胞3次，每次5 min。封片：避光条件下，从孔中取出细胞爬片，用封片剂将其固定于载玻片上，进行荧光检测。

1.2.4 细胞转染

利用siRNA有效敲低PC-3中hsa_circ_0001922的表达，设计两条特异性siRNA分子，序列分为si-hsa_circ_0001922(1)：CATTTGGCAGAGATCGTAA；si-hsa_circ_0001922(2)：GCAGAGATCGTAAAGCTGA。siRNA转染分组：PC-3+si-NC、PC-3+si-hsa_circ_0001922(1)、PC-3+si-hsa_circ_0001922(2)。其中si-NC为阴性对照组。按照siRNA说明书设置四组浓度：33、50、100和150 nmol/L。当细胞生长至30%~40%时进行转染。以24孔板为例，首先取1.5 ml EP管，管中加入Opti-MEM和Lipofectamine2000，混匀后静置5 min；加siRNA、siNC混匀，静置20 min；将培养板中的培养基换成无FBS的基本培养基；混匀液滴加至24孔板中，轻微晃动培养板，置于培养箱中培养，4~6 h后换含FBS的培养基。48 h后进行qRT-PCR和Western blot实验。

1.2.5 克隆形成实验

转染后消化各实验组细胞并用含10%FBS的RPMI1640培养基重悬，调整细胞密度，使六孔板每孔接种1 000个细胞并置于37℃、5%CO₂的培养箱培养两周，待形成肉眼可见的单克隆后终止培养。PBS冲洗细胞，每孔加入1 ml 4%的多聚甲醛，于4℃固定1 h后吸弃，每孔加入1 ml结晶紫染色10 min后吸弃染料，并用流水轻轻冲洗，室温晾干后拍照保存结果。以上实验重复三次。

1.2.6 划痕实验

转染后的PC-3细胞接种至24孔板，待细胞过夜贴壁长至80%后弃培养液，用200 μl无菌枪头进行划痕，并于0、6和24 h在显微镜下观察拍照。Image J软件计算细胞的迁移面积百分比。以上实验重复三次。

1.2.7 Transwell侵袭实验

将Matrigel基质胶和RPMI1640培养基以1:5比例稀释后滴加至Transwell小室的上室，振荡混匀后置于37℃培养箱凝固过夜。取对数期生长的PC-3细胞进行相应转染处理后重悬于无血清的RPMI1640培养基中，调整合适细胞密度为2.5×10⁵个/毫升，吸取200 μl细胞悬液加至上室，下室加入600 μl含15%FBS的RPMI1640培养基。常规培养48~72 h后，取出Transwell小室，吸弃培养液，用棉签轻轻擦净上室细胞，PBS冲洗三次，4%多聚甲醛固定20 min，室温晾干后用结晶紫染色15 min，流水轻轻冲洗，室温晾干后于显微镜下观察并拍照，随机观察5个视野，Image J软件计数穿膜细胞的数目。上述实验重复三次。

1.2.8 蛋白质免疫印迹

总蛋白的提取：按索莱宝全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，并采用BCA法测定蛋白浓度。100℃加热10 min使蛋白质变性。10%分离胶进行SDS-PAGE电泳，半干法PVDF膜转移蛋白。5%的脱脂奶粉于摇床室温封闭2 h，TBST洗涤3次后，分别加入E-cadherin（1:5 000）、Vimentin（1:2 000）一抗，4℃过夜，隔天TBST洗涤3次，每次10 min，孵育对应的二抗1.5 h，TBST洗涤3次，加入显色液曝光。使用Image J软件分析目的蛋白条带的灰度值。蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

1.3 统计学方法

采用GraphPad软件进行统计分析，两组样本比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 hsa_circ_0001922在前列腺癌PC-3细胞中表达水平上升

qRT-PCR检测结果显示，与正常前列腺上皮细胞RWPE-1相比，前列腺癌PC-3细胞中hsa_circ_0001922表达水平显著上升，差异有统计学意义（1.03 vs. 4.34, P=0.003）。RNA FISH实验发现，Cy3标记hsa_circ_0001922探针的荧光大部分存在于细胞质中，少部分定位于细胞核，见图 1。

2.2 siRNA敲低hsa_circ_0001922的表达

当si-hsa_circ_0001922浓度为100 nmol/L时，抑制效果最好（P < 0.05），见图 2。

2.3 敲低hsa_circ_0001922对前列腺癌PC-3细胞生物学功能的影响

根据上述结果，选择100 nmol/L si-hsa_circ_0001922转染细胞做进一步实验。平板克隆形成实验结果显示，与si-NC组相比，转染了si-hsa_circ_0001922的PC-3细胞克隆数下降，差异有统计学意义（P=0.0058, P=0.0087）；Transwell侵袭实验结果表明，转染si-hsa_circ_0001922抑制了PC-3细胞侵袭能力（P=0.0183, P=0.0121）；24 h划痕实验结果显示，转染si-hsa_circ_0001922组PC-3迁移的速度下降（P=0.0046, P=0.0009），见图 3。

2.4 hsa_circ_0001922促进前列腺癌EMT进程

综上结果，si-hsa_circ_0001922（2）敲低效果较好，因此收集转染si-hsa_circ_0001922（2）的PC-3细胞，并提取RNA和蛋白质。实验结果显示，敲低hsa_circ_0001922使E-cadherin mRNA表达水平升高，Vimentin mRNA表达水平下降（均P < 0.05）。进一步蛋白免疫印迹结果显示敲低hsa_circ_0001922后，E-cadherin的蛋白水平上升（P=0.0085），Vimentin的蛋白水平下降（P=0.0089），见图 4。

3 讨论

有研究表明，预计到2030年，发展中国家以及亚洲地区65岁以上人群的前列腺癌发病率将急剧上升^[17]。因此，阐明前列腺癌的进展机制对于发现前列腺癌的防治极其重要。

虽然雄激素受体（AR）途径对PCa的进展有重要作用^[18]，然而，多种非AR依赖性途径在PCa进展中的作用也不容忽视。目前已经发现，环状RNAs表达异常与多个肿瘤发生发展相关。例如：Zeng等^[19]报道了circANKS1B在三阴性乳腺癌中显著上调，并通过诱导上皮间质转化促进乳腺癌的侵袭和转移。Wei等^[20]研究显示，相对于健康肺组织，circPTPRA在非小细胞肺癌中显著下调，较低水平的circPTPRA与NSCLC转移和较差的生存结果相关。

本研究发现，hsa_circ_0001922表达在前列腺癌细胞PC-3中显著升高。hsa_circ_0001922是由HUWE1的外显子反向剪接而成，其在细胞中的作用目前尚未见报道。进一步研究发现，敲低hsa_circ_0001922后，PC-3细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降。与对照组相比，PC-3细胞克隆数、迁移和侵袭细胞数显著下降（P < 0.05），并初步证实，hsa_circ_0001922这一作用可能是通过促进EMT进程实现的。Li等^[21]报道了hsa_circ_0016068通过miR-330-3p/BMI-1途径信号增强PCa细胞的增殖和侵袭能力。Feng等^[22]也证实来源于XIAP的hsa_circ_RNA0005276通过与FUS结合蛋白相互作用激活XIAP的转录，进而促进PCa细胞增殖、迁移和转移。

在前列腺癌进展过程中，上皮细胞可以经历上皮间质转化，导致细胞间黏附丧失，从而使癌细胞迁移或转移到不同的器官^[23]。而前列腺癌转移是大多数前列腺癌患者死亡的关键因素^[24]。

本研究发现敲低hsa_circ_0001922后，E-cadherin的表达水平上调，Vimentin的表达水平下调。上皮标志物E-cadherin在细胞间起着黏附的作用，而间充质标志物Vimentin是中间丝的其中一种蛋白质，能调节细胞骨架内蛋白间的相互作用。在癌症进展过程中，E-cadherin的丢失以及Vimentin的增加，加强了癌细胞与原始肿瘤块的分离和侵袭性^[25]，最终造成癌症转移。

综上，本研究证实了环状RNA调控EMT进程是前列腺癌进展的重要一环。hsa_circ_0001922在PC-3生长和转移中发挥关键作用，这一作用可能是通过促进PC-3细胞EMT进程实现的。未来将进一步证实hsa_circ_0001922作为miRNA的海绵，或者直接结合EMT相关蛋白的方式来影响EMT进程的分子机制。

作者贡献：

张妍妍：实验设计及论文撰写

赵敏、刘静：细胞培养

郭红燕、胡银英、赵林：课题思路指导

王志刚：论文指导