文章信息
- LncRNA FENDRR通过调控ERK/MAPK影响肺鳞癌H226细胞增殖、迁移和凋亡
- LncRNA FENDRR Affect Proliferation, Migration and Apoptosis of Lung Squamous Cell Carcinoma H226 Cells via ERK/MAPK Signaling Pathway
- 肿瘤防治研究, 2022, 49(6): 563-568
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2022, 49(6): 563-568
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1193
- 收稿日期: 2021-10-21
- 修回日期: 2022-02-09
在非小细胞肺癌(NSCLC)中,肺鳞状细胞癌(LUSC)是第二大常见的肺癌类型,占NSCLC的30%,吸烟患者占90%[1]。最新的分子病理学检测和靶向治疗能够显著延长肺腺癌患者的总生存。目前还没有特异生物标志物或靶向药物,可用于早期检测或治疗LUSC患者。许多研究发现,长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)作为重要的生物学和基因调节因子,在肿瘤发生发展中扮演着重要的角色,人们尝试以lncRNA作为疾病特异生物标志物或治疗靶点。
胎儿致死非编码发育调节RNA(fetal-lethal non-coding developmental regulatory RNA, FENDRR)是一种新的lncRNA,研究表明它在骨肉瘤、乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中异常表达[2-5]。Li等[3]研究发现FENDRR在乳腺癌细胞系和癌组织中的表达低于相邻正常组织,过表达FENDRR能抑制乳腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡。最近,多个全基因测序结果研究发现,lncRNA FENDRR在肺腺癌细胞中低表达[5-7]。对TNMⅠ期肺腺癌组织和邻近癌旁组织的RNA测序结果显示,肺腺癌组织中lncRNA FENDRR的表达明显降低[7],另一项研究对肺腺癌组织和邻近肺正常组织的差异转录组分析,也证实肺腺癌中FENDRR明显下降[5]。Zhang等[8]进一步研究表明,FENDRR能够通过海绵吸附miR-761,释放金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP2)的抑癌功能,降低肺腺癌细胞的侵袭能力。然而,FENDRR在肺鳞状细胞癌中的生物学和机制方面的研究知之甚少。因此,本研究分析lncRNA FENDRR对肺鳞癌H226细胞进展进程的影响,探讨FENDRR影响肺鳞癌H226细胞发生发展的潜在机制,为治疗肺鳞癌提供新的临床依据。
1 材料与方法 1.1 材料正常肺上皮细胞BEAS-2B购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库,肺腺癌细胞(A549、NCI-H1299)、肺鳞癌细胞(NCI-H226)购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库;胎牛血清(四季青公司)、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司);Lipofectamine 2000、RNA提取试剂(美国Invitrogen公司);lncRNA FENDRR小干扰RNA(FENDRR-siRNA)及其阴性对照(FENDRR-siNC)(上海吉玛公司);Real-time PCR引物(上海捷瑞公司);CCK-8试剂盒、结晶紫染色液(上海碧云天生物公司);Matrigel、Transwell板(美国Corning公司);丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(p-MEK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)和β-actin单克隆抗体(美国CST公司)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(英国Abcam公司);反转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒(南京Vazyme公司);酶标仪(英国BioTek公司);Real-time PCR仪(美国Applied Biosystems公司);荧光显微镜(美国Alpha公司);流式细胞仪(美国BD公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养非小细胞肺癌A549、NCI-H1299、NCI-H226细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,正常肺上皮细胞BEAS-2B用含10%胎牛血清的DMEM培养基,于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。每2天换液,3~5天用0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2.2 细胞转染及分组取对数生长期细胞,常规消化后,接种至6孔板或96孔板,过夜待细胞生长密度约50%~60%时,将Lipofectamine2000与FENDRR-siRNA或FENDRR-siNC混合,室温孵育20 min后转染细胞。转染后继续培养48 h,收集细胞用于后续实验。
1.2.3 RNA提取和实时定量聚合酶链式反应检测收集的细胞加入1 ml TRIzol试剂,充分混匀,用氯仿抽提总RNA,酶标仪测定RNA纯度和浓度。按照反转录试剂盒说明书配制第一链cDNA混合液(5×HiScriptⅡqRT SuperMix 4 μl、RNA模板2 μl、去离子水补齐至20 μl)合成cDNA,反应程序:50℃ 15 min;85℃ 5 s。cDNA为模板配制qRT-PCR混合液(2×AceQ qPCR SYBR Green 10 μl、正向引物和反向引物各1 μl、cDNA 1 μl、去离子水补齐至20 μl)进行qRT-PCR检测,反应程序:95℃ 5 min;95℃ 15 s;60℃ 30 s,共40个循环。引物序列:lncRNA FENDRR: F: 5’-GAGCACATGATGGCACAATAG-3’,R: 5’-CCAACAGATATTCGCAGTCC-3’;GAPDH: F: 5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3’,R: 5’-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3’。转染效率用2-ΔΔCT计算。
1.2.4 Western blot检测MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表达转染48 h后收集细胞,加入0.2 ml RIPA细胞裂解液,冰上裂解30 min,4℃、12 000 r/min离心15 min取上清液。BCA法测定上清蛋白含量,加入5×上样缓冲液混匀,100℃煮沸5 min,-20℃保存备用。样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,然后电转至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h,PBST洗涤3次、5分钟/次,分别加入一抗MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、β-actin(1:1000),4℃孵育过夜,PBST洗涤3次、5分钟/次,加入二抗(1:5000),室温孵育1.5~2 h,PBST洗涤3次、10分钟/次,于暗室扫描拍照。采用Image-pro plus软件分析各条带灰度值,与内参β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。
1.2.5 CCK-8法测定细胞活力取对数生长期的细胞,用含10%血清的RPMI 1640培养基调整浓度至每毫升3×104个,每孔100 μl的量接种至96孔板,每组3个重复,过夜后进行转染,分别在24、48和96 h加入每孔10 μl的CCK-8溶液,继续培养4 h,酶标仪测定450 nm处吸光度(A),
迁移:转染48 h后收集的各组细胞用无血清的RPMI 1640培养基调整浓度至每毫升2×105个,Transwell小室置于24孔板,加入100 μl细胞悬液,下室加入600 μl含10%胎牛血清RPMI 1640培养基,培养12 h取出小室,棉签擦去上层小室细胞,甲醇固定30 min,结晶紫染色20 min后,显微镜观察。随机选取5个视野进行计数。侵袭:转染48 h后收集的各组细胞用无血清的RPMI 1640培养基调整浓度至每毫升2×105个,4℃过夜的Matrigel胶与无血清培养基1:20混合,加至Transwell小室,37℃、1 h后吸掉剩余液体,加入200 μl细胞悬液,下室加入600 μl含10%胎牛血清RPMI 1640培养基,培养24 h取出小室,棉签擦去上层基质胶和小室细胞,后续操作与迁移实验一致。
1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡转染48 h后收集各组细胞,用PBS洗涤2次,4℃、1 000 r/min离心5 min取沉淀,1×Annexin V-FITC结合液重悬细胞。分别加入Annexin V-FITC抗体5 μl和PI(100 mg/ml)2 μl,室温避光15 min。加入400 μl PBS,流式细胞术检测细胞凋亡情况。使用拟合软件Flow J分析细胞凋亡,凋亡率为早期凋亡率和晚期凋亡率的总和。
1.2.8 生物信息学分析工具利用RNAInter数据库(http://www.rnainter.org/)筛选出与FENDRR相互作用的基因,DAVID数据库在线分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)用于互作基因的KEGG信号通路富集分析。
1.3 统计学方法用SPSS19.0软件进行统计分析,计量资料均以(x±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。每个实验组设置3个重复,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 lncRNA FENDRR在非小细胞肺癌细胞中的表达qRT-PCR结果显示,与正常肺上皮细胞BEAS-2B相比,肺腺癌细胞A549、H1299、肺鳞癌细胞H226中FENDRR相对表达量均降低,差异有统计学意义(P < 0.01),见图 1A。肺鳞癌细胞H226用于后续体外实验。与阴性对照组相比,沉默H226细胞中FENDRR后,FENDRR-siRNA组中FENDRR相对表达量显著下降,差异有统计学意义(P < 0.01),见图 1B。
2.2 下调lncRNA FENDRR对肺鳞癌NCI-H226细胞增殖、凋亡的影响CCK-8结果显示,与阴性对照组相比,FENDRR-siRNA组在48、72 h下检测OD值显著增加,差异有统计学意义(P < 0.001),表明下调FENDRR促进H226细胞增殖活力,见图 2A。与阴性对照组相比,FENDRR-siRNA组H226细胞凋亡率明显减少,差异有统计学意义(P < 0.01),见图 2B、C。
2.3 下调lncRNA FENDRR对肺鳞癌H226细胞迁移、侵袭的影响Transwell小室结果显示,与阴性对照组相比,FENDRR-siRNA组中H226迁移细胞数显著增多,差异有统计学意义(P < 0.001),见图 3A,FENDRR-siRNA组中H226侵袭细胞数显著增多,差异有统计学意义(P < 0.001),图 3B。
2.4 下调lncRNA FENDRR促进ERK/MAPK通路Western blot结果显示,与阴性对照组相比,FENDRR-siRNA组中p-MEK、p-ERK蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P < 0.05),见图 4。
2.5 抑制ERK对肺鳞癌H226细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响与FENDRR-siRNA组相比,FENDRR-siRNA+5 μmol/L U0126组中H226细胞活力明显降低,差异有统计学意义(P < 0.05),见图 5A,迁移细胞数和侵袭细胞数明显减少,差异有统计学意义(P < 0.05、P < 0.01),见图 5B,凋亡的细胞比例显著升高,差异有统计学意义(P < 0.05),见图 5C。
2.6 FENDRR相互作用的基因预测及富集分析通过RNAInter工具筛选出2 671个可能与FENDRR相互作用的基因,有2 623个基因在DAVID数据库中有信号通路信息。对这些基因进行KEGG富集分析显示,主要富集于Metabolic pathways、Pathways in cancer、MAPK signaling pathway等,见表 1。
3 讨论长链非编码RNA(lncRNA)并不具备编码蛋白的潜力,但在许多疾病中存在异常表达[9-11],提示lncRNA可能参与肿瘤发生、化疗耐药、纤维化和炎性疾病等发病过程。最近,研究发现lncRNA FENDRR在多种肿瘤类型中出现异常表达[3-4],尤其NSCLC[6, 12],并在肿瘤进展过程中扮演重要角色,展现出其作为新的分子生物标志物用于肿瘤诊断、预后和治疗的潜力。
肺鳞状细胞癌是肺癌中第二大常见的组织学亚型。与肺腺癌相比,其基因组异质性特征更为复杂,目前尚无特异性的驱动基因和靶向药物。本研究发现,FENDRR在肺鳞癌H226细胞中的表达显著下调,FENDRR对肺鳞癌细胞的影响尚不明确。越来越多的研究发现,FENDRR作为抑癌或促癌基因,通过多种机制对细胞功能和基因表达发挥重要的调节作用。Zhou等[13]研究发现,FENDRR在胃癌细胞Kato Ⅲ中高表达,其作为促癌基因,与富含丝氨酸/精氨酸剪接因子1(serine/arginine rich splicing factor 1, SRSF1)相互作用,从而释放巨噬细胞刺激1受体(macrophage stimulating 1 receptor, MST1R)信号通路促进胃癌的进展。而大部分FENDRR作为抑癌基因,调节肿瘤细胞生物学特性和基因表达。一项研究证实在肝癌细胞中过表达FENDRR,能够抑制肝癌细胞活力,促进细胞凋亡[14],而另一项研究发现,FENDRR还可以通过抑制Treg介导的肝癌细胞免疫逃逸,降低肝癌细胞的增殖[15]。为了探讨FENDRR在肺鳞癌H226细胞中的作用,本研究发现下调FENDRR表达,能够显著增强肺鳞癌H226细胞的增殖活力、迁移和侵袭能力,并抑制H226细胞凋亡。结果表明FENDRR在肺鳞癌H226细胞中作为抑癌基因,在H226细胞发展进程中发挥调节作用。
过度活化ERK/MAPK信号通路会促进肿瘤增殖、侵袭和转移的能力[16]。本研究通过RNAInter在线工具提取了FENDRR相互作用的基因,对这些基因进行富集分析结果提示,FENDRR可能与MAPK通路相关。进一步实验发现,下调FENDRR激活了肺鳞癌H226细胞的ERK/MAPK信号级联,明显促进H226细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并抑制细胞凋亡,而加入ERK抑制剂U0126后发现,能够显著抑制H226细胞的增殖活力、迁移和侵袭能力,并诱导细胞凋亡。证实FENDRR可能通过调控ERK/MAPK通路,调节肺鳞癌H226细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。
综上所述,FENDRR在肺鳞癌H226细胞中低表达,下调FENDRR可以调控ERK/MAPK促进细胞增殖、转移、侵袭并抑制细胞凋亡。ERK抑制剂U0126能够逆转这一现象,为肺鳞癌临床治疗提供依据,但FENDRR在肺鳞癌中的靶基因及调节机制尚不清楚,仍需进一步深入研究。
作者贡献:
郑建洲:实验操作、结果整理及论文撰写
白煜:协助实验操作及数据分析
戚春建:实验设计及文稿修改
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