0 引言

内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）是细胞受到钙稳态失衡、能量缺失、氧化还原环境改变、局部缺血、病毒感染等因素的影响，导致错误折叠或未折叠蛋白质在内质网腔中堆积，细胞所产生的应激反应，是细胞的自我保护机制。细胞发生ERS时，未折叠蛋白信号（unfold protein response, UPR）通路被激活，减少蛋白质翻译，促进蛋白质恢复正确构象，使细胞恢复稳态^[1]；但过强或者是长时间的ERS，UPR信号通路则促发CHOP凋亡信号通路，诱导细胞死亡^[2]。研究表明，肿瘤细胞较快的生长速度和血液供应不足，使肿瘤细胞处于低氧、低pH、能量缺乏的微环境中，导致错误折叠蛋白在内质网腔中积累，最终引起ERS^[3-4]。ERS介导的凋亡途径与多种肿瘤的发生发展密切相关，通过诱导ATF6、CHOP等基因表达可以促进肿瘤细胞凋亡^[5-6]，ERS介导的细胞凋亡是肿瘤治疗的潜在机制。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）占原发性肝癌的主要病理类型。世界卫生组织估计，2030年将有超过100万患者死于肝癌^[7-8]。凋亡抵制在HCC的发生发展过程中发挥重要作用，也是HCC对化疗药物产生抗药性的主要原因^[9-10]。Pin1是一种肽基脯氨酰胺顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase, PPIase），可特异性结合并催化磷酸化的丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸基序（pSer/Thr-Pro motif）发生顺反异构，改变靶蛋白的活性、稳定性或亚细胞定位^[11]。Pin1在包括HCC在内的多种肿瘤组织中高表达，可以调节多个靶标分子的活性，参与各类细胞应激应答、调控细胞增殖和凋亡^[12-13]。有研究发现在人结直肠癌细胞HCT116发生ERS时，Pin1表达量减少，细胞凋亡数量增加^[14]；研究表明HepG2细胞中Pin1异构酶活性比其他肝癌细胞株高^[15]，ERS状态下HepG2细胞中Pin1的表达情况和作用尚不清楚，因此本研究利用ERS诱导剂——衣霉素（tunicamycin, TM）诱导HepG2细胞产生ERS，检测Pin1蛋白水平变化，探讨Pin1在ERS状态下对HepG2细胞增殖和凋亡的影响，为特异性提高ERS介导的细胞凋亡敏感度作为肝癌治疗策略提供新思路。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 主要试剂

衣霉素（TM）、全反式维甲酸（ATRA）购自美国Sigma公司，CCK-8试剂盒、Actin抗体（HC201-02）购自北京全式金生物技术有限公司，Bip抗体（11587-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司，Pin1抗体（#3722）购自美国Cell Signaling Technology公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所，Annexin V FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，DMEM、PBS、胰酶购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.1.2 细胞系

人正常肝细胞THLE3和人肝癌细胞HepG2购自中国科学院细胞库。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

HepG2细胞、THLE3细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基、在37℃、5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养，1~2 d换液一次，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞增殖检测

实验分组：（1）THLE3细胞TM组：设置0（只加DMSO）、1、2、4、6、8 μg/ml六个TM浓度；（2）HepG2细胞TM组：六个TM浓度同组（1）；（3）HepG2细胞TM+ATRA组：在组（2）的六个TM浓度上分别加25 μmol/L ATRA。实验步骤：取对数生长期细胞，经胰酶消化后，按5×10³个细胞每孔接种于96孔板中，每个浓度设置3个复孔，培养箱培养12 h后，加入指定浓度的TM或ATRA，再培养48 h后，在每孔200 μl培养基中加入20 μl CCK-8试剂，37℃孵育1 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光值（A）。细胞增殖抑制率$ \left( {{\rm{IR}}} \right) = \left( {1{\rm{ - }}A{{\rm{值}}_{{\rm{实验组}}}}/A{{\rm{值}}_{{\rm{对照组}}}}} \right) \times 100\% $ 。以药物浓度为横坐标，以增殖抑制率为纵坐标，绘制生长曲线。

1.2.3 Western blot实验

实验分组与细胞增殖检测相同，分别为：（1）THLE3细胞TM组；（2）HepG2细胞TM组；（3）HepG2细胞TM+ATRA组。实验步骤：取对数生长期细胞，按（1.5~2）×10⁵个细胞每孔接种于6孔板中，培养箱培养12 h后，加入指定浓度的TM或ATRA，继续培养48 h后，用RIPA细胞裂解液提取蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，蛋白样本与上样缓冲液充分混匀后，95℃金属浴10 min。进行聚丙烯凝胶电泳（浓缩胶5%，分离胶10%），分离蛋白后用湿转法转印至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封闭液中封闭1 h，一抗室温孵育3 h，TBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，采用ECL化学发光。采用Image J软件进行蛋白质相对定量分析。

1.2.4 细胞凋亡检测

实验组：4 μg/ml TM作用于THLE3细胞，4 μg/ml TM、25 μmol/L ATRA、4 μg/ml TM+25 μmol/L ATRA分别作用于HepG2细胞，以DMSO处理的细胞作为对照组。实验步骤：取对数生长期细胞，按3×10⁵个细胞每孔接种于6孔板，12 h后进行加药处理，48 h后收集加药实验组细胞和对照组细胞，用结合缓冲液重悬细胞进行计数，取2×10⁵个细胞重悬于100 μl结合缓冲液中，加入5 μl FITC Annexin V和5 μl PI染料，轻柔混匀，室温避光染色15 min后，每管加入400 μl结合缓冲液，混匀后上流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 8统计软件进行分析，所有数据以（ x±s ）表示，两组间数据采用双尾非配对t检验，多组间采用单因素方差分析，检验水准为α=0.05。

2 结果 2.1 ERS状态下Pin1蛋白水平变化

Western blot结果显示，随着TM浓度的升高，THLE3和HepG2细胞内ERS标志物Bip蛋白表达水平增高，说明细胞发生ERS。与DMSO对照组比较，THLE3细胞发生ERS后，Pin1蛋白水平逐渐减少，差异有统计学意义（均P=0.000），见图 1A；而HepG2细胞中Pin1蛋白表达差异无统计学意义（均P > 0.05），见图 1B。

2.2 ERS状态下细胞的增殖变化

CCK-8检测结果显示，与HepG2 TM组相比，THLE3 TM组细胞增殖被明显抑制，差异有统计学意义（均P=0.000），见图 2。

2.3 ERS状态下细胞的凋亡变化

Western blot检测显示，TM组细胞Bip蛋白水平上调，说明细胞发生ERS；HepG2细胞Pin1的本底水平高于THLE3，差异有统计学意义（P=0.000），见图 3A；与DMSO组相比，THLE3 TM组细胞中Pin1的蛋白水平显著减少（P=0.000），而HepG2 TM组细胞中的Pin1表达不受影响，见图 3A。流式细胞术结果显示，与THLE3细胞DMSO组（（3.57±0.31）%）相比，TM组的细胞凋亡率（（22.25±0.78）%）升高，差异有统计学意义（P=0.001），见图 3B、C、F；HepG2细胞DMSO组和TM组的凋亡率分别为（5.10±1.00）%和（7.36±0.11）%，两组比较差异无统计学意义（P=0.086），见图 3D、E、F。表明ERS诱导剂TM会促进正常肝细胞的凋亡，而不能促进HepG2细胞凋亡，Pin1蛋白可能在其中发挥重要作用。

2.4 ATRA降低ERS状态下HepG2细胞中Pin1的表达

Western blot结果显示，TM和ATRA的共同作用下，HepG2细胞中ERS标志物Bip蛋白水平随着TM浓度的升高而增加，说明细胞发生ERS；Pin1蛋白水平随着TM浓度的增加而减少，除1 μg/ml TM组外，其他TM浓度组与0 μg/ml TM组比较，差异均有统计学意义（均P < 0.01），见图 4。

2.5 ATRA对ERS状态下HepG2细胞增殖的影响

CCK-8实验结果显示，与TM组相比，TM+ATRA组细胞增殖抑制率明显升高，差异有统计学意义（均P < 0.01），见图 5。提示降低Pin1的蛋白水平，可以增加ERS对HepG2细胞增殖的抑制能力。

2.6 ATRA对ERS状态下HepG2细胞的凋亡影响

流式细胞术结果显示，与DMSO组（（5.10±1.00）%）相比，HepG2细胞TM组的细胞凋亡率（（7.36±0.11）%）有所升高，但差异无统计学意义（P=0.086）；ATRA组（（10.03±0.49）%）和TM+ATRA组（（23.70±0.75）%）的细胞凋亡率均显著升高，差异有统计学意义（P_ATRA组=0.024, P_TM+ATRA组=0.002），见图 6。表明抑制Pin1蛋白，可提高ERS诱导HepG2细胞凋亡的作用。

3 讨论

ERS是机体的自我保护机制，细胞通过UPR信号通路恢复内质网功能，维持细胞稳态，促进细胞存活；当细胞过度损伤，无法恢复正常功能，ERS激活CHOP/GADD153细胞凋亡信号通路，清除受损细胞，维护机体生理平衡^[16]。通过诱导肿瘤细胞发生ERS介导的细胞凋亡是一种新的肿瘤治疗策略，但有研究表明，即使给予ERS诱导剂，肿瘤细胞的凋亡率并没有明显增加，说明肿瘤细胞可以抵制ERS介导的细胞凋亡^[17]。本研究用ERS诱导剂TM作用于正常肝细胞THLE3和肝癌细胞HepG2，结果显示正常肝细胞发生ERS后，细胞增殖抑制率和细胞凋亡率显著增加，而HepG2细胞中没有明显变化。

HCC是常见的恶性肿瘤，具有发生隐匿、发展迅速、恶性程度高等特点，多数患者确诊时已到了中晚期，错过了手术的最佳时机，因此化疗是主要的治疗方法，但由于存在化疗抗药的情况，其治疗效果并不理想^[18]。凋亡抵制与肿瘤的发生发展密切相关，也是HCC对化疗药物产生抗药性的主要原因^[19]。研究HCC凋亡抵抗的原因和调控机制，对特异性提高细胞的凋亡敏感度，增强治疗效果具有重要意义。既往研究表明，过表达Pin1蛋白可以保护HCT116细胞免受ERS诱导的细胞凋亡^[14]；而与正常细胞相比，HepG2细胞中Pin1表达较高，且具有较强的异构酶活性^[15]。那么Pin1在HepG2细胞中是否也起到了抵抗ERS所诱导的细胞凋亡的作用？本研究结果显示，与正常肝细胞相比，HepG2细胞发生ERS后，Pin1蛋白仍然维持在一定水平，且细胞增殖未受明显影响。但在加入Pin1抑制剂ATRA后，细胞的增殖抑制率和凋亡率明显增加。Jeong等研究报道表明，ERS状态下人结直肠癌细胞通过p53抑制Pin1的表达，从而促进细胞凋亡^[14]，然而ERS状态下HepG2中Pin1的表达调控及其蛋白稳定性调控还需进一步探讨；Bae等报道与Huh7、HLE等肝癌细胞系相比，HepG2细胞中p53是野生型的，Pin1蛋白表达相对较少，但异构酶活性较高^[15]，这些差异是否会影响肝癌细胞应对ERS介导的细胞凋亡，还需要进一步实验。

综上所述，在HepG2细胞中Pin1蛋白可以抵制ERS诱导的细胞凋亡，Pin1有可能成为提高ERS介导的凋亡敏感度的潜在靶点。联合ERS诱导剂和Pin1抑制剂是否能有效的治疗肝癌，还需进一步在更多的肝癌细胞株以及肿瘤小鼠模型中开展实验。

作者贡献：

江铭婷：实验设计及实施、论文撰写

黄晶：实验实施

郑淑萍：数据分析