0 引言

食管癌是发生于食管上皮组织的恶性肿瘤，是消化道常见的恶性肿瘤之一，早期诊断率较低、预后较差且死亡率较高^[1-4]。在中国，食管癌的发病类型以食管鳞癌为主，占食管癌90%以上^[5]。DNA损伤关键蛋白减数分裂重组蛋白11同系物A（meiotic recombination 11 homolog A, MRE11）是DNA损伤募集因子MRE11-RAD50-Nbs1（MRN）复合物的重要组分，在DNA损伤的感知和修复中起关键的作用^[6-8]。研究表明，MRE11具有促进肿瘤发生的作用^[9]，如MRE11高表达可促进乳腺癌的发生和发展^[10]。然而，尚无关于MRE11与食管鳞癌发生发展关系的报道。有文献表明，MRE11可调控成纤维细胞中AKT的活性，且在淋巴细胞中AKT具有上调c-myc的作用^[11-12]。另外，c-myc可促进食管鳞癌细胞增殖和抑制凋亡^[13-14]。本研究拟通过干扰MRE11探究其对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的作用及相关机制。

1 材料与方法 1.1 材料

Het-1A（货号：CRL-2692）购自美国ATCC公司；Ec9706和TE-1购自中国医学科学院肿瘤研究所医院分子肿瘤学国家重点实验室；胎牛血清（货号：SH30084.02）、RPMI1640（货号：SH30809.01）培养基购自美国HyClone公司；BCA试剂盒（货号：P0010）购自碧云天生物技术有限公司；MRE11兔单抗（货号：ab109623）、AKT兔多抗（货号：ab8805）、磷酸化AKT兔单抗（phospho S473，货号：ab81283）、c-myc兔单抗（货号：ab32072）、GAPDH兔单抗（货号：ab8245）和HRP标记的山羊抗兔IgG（货号：ab150077）均购自美国Abcam公司；BrdU试剂盒（货号：QIA58）购自美国Sigma公司；Annexin-V FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（货号：556547）购自美国PharMingen公司；Caspase-3活性检测试剂盒（货号：556485）购自美国BD公司；MRE11 siRNA（货号：siB161221091618-1-5）和无关对照siRNA（货号：siN0000001-1-5）购自广州锐博生物公司。

1.2 细胞培养及分组

人食管上皮细胞Het-1A、人食管鳞癌细胞Ec9706和TE-1均培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于5%CO₂培养箱，37℃饱和湿度条件下常规传代培养。分组如下：Het-1A组（人食管上皮细胞），Ec9706和TE-1组（食管鳞癌细胞），control组（正常培养的食管鳞癌细胞），MRE11 si组（转染MRE11 siRNA的食管鳞癌细胞），non-spe组（转染non-specific siRNA的食管鳞癌细胞），MRE11 si+0、0.1、0.5、1、1.5、1.8和2 μg/ml SC79组（下调MRE11后0、0.1、0.5、1、1.5、1.8和2 μg/ml SC79孵育细胞24 h），MRE11 si+pc组（转染MRE11 siRNA和pcDNA3.1的细胞）和MRE11 si+c-myc组（转染MRE11 siRNA和pcDNA3.1-c-myc的细胞）。

1.3 Western blot检测MRE11、磷酸化AKT和c-myc蛋白表达量

收集细胞，加入细胞裂解液，冰浴25 min后收集蛋白，BCA法测定其浓度。蛋白样品与上样缓冲液充分混匀后，置于100℃沸水中变性5 min。取25 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后电转移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封闭后加入一抗：MRE11兔单抗（1:1 000）、AKT兔多抗（1:500）、磷酸化AKT兔单抗（1:5 000，phospho S473）、c-myc兔单抗（1:1 000）或GAPDH兔单抗（1:1 000），4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育2 h。ECL发光试剂浸泡膜显影，凝胶成像系统观察结果。GAPDH为内参对照蛋白。以目的蛋白条带与GADPH灰度比值表示蛋白相对表达水平。

1.4 c-myc过表达载体的构建和细胞转染

TRIzol法提取待测细胞的总RNA，以总RNA为模板反转cDNA，PCR扩增c-myc（GenBank accession number NM_002467）全长（包括酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ）序列，扩增产物分别与质粒pcDNA.3.1同时进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接，转化到DH5α中扩增，筛选阳性克隆，鉴定，测序，将测序正确的质粒命名为pcDNA.3.1-c-myc。将Ec9706和TE-1分别接种于96孔板，于37℃、5%CO₂环境下培养12 h，待细胞融合达到80%，按照转染试剂操作说明进行细胞转染实验。将分别含有pcDNA.3.1-c-myc（3 μg）、pcDNA.3.1（3 μg）、MER11 siRNA（5′-GGA GGU ACG UCG UUU CAG AdTdT-3′，3 μg）或无关对照siRNA（3 μg）的转染试剂与200 μl不含血清的RPMI-1640培养基混合加入各孔，37℃、5%CO₂孵育24 h，Western blot检测转染效率。

1.5 Caspase-3活性检测

收集细胞，按照Caspase-3活性检测试剂盒说明书检测Caspase-3活性，酶标仪测定420 nm处吸光度。

1.6 Annexin-V FITC/PI检测细胞凋亡

按照Annexin-V FITC/PI试剂盒说明书检测细胞凋亡，首先用磷酸盐缓冲溶液预冷细胞，然后用Annexin-V FITC（13 µl）于4℃孵育细胞28 min，PBS洗涤细胞一次，加入10 µl PI孵育7 min。流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况。

1.7 BrdU检测细胞增殖

按照BrdU ELISA试剂盒说明书检测各组Ec9706和TE-1细胞的增殖能力，将Ec9706和TE-1细胞分别接种于96孔板进行转染，24 h后每孔加入12 μl BrdU，孵育1.5 h。去上清液，加入100 μl变性溶液孵育细胞15 min。相继加入BrdU抗体和二抗，最后加入四甲基联苯胺（TMB）孵育25 min。酶标仪检测450 nm处吸光度。

1.8 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计学分析，数值均采用（均数±SEM）表示。两组均数间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MRE11在食管鳞癌细胞中表达量升高

Western blot检测结果表明，Ec9706和TE-1细胞中MRE11的蛋白表达量较人食管上皮细胞Het-1A显著升高（P=0.0109和P=0.0325），见图 1。

2.2 下调MRE11表达抑制食管鳞癌细胞增殖

与non-spe组比较，MRE11 si组中Ec9706和TE-1细胞中MRE11的蛋白表达量显著降低（P=0.0168和P=0.0117），细胞转染成功，MRE11 si组Ec9706和TE-1细胞增殖能力显著下降（P=0.0135和P=0.0103），见图 2。

2.3 下调MRE11表达促进食管鳞癌细胞凋亡

与non-spe组比较，MRE11 si组Ec9706和TE-1细胞凋亡率显著升高（P=0.0398和P=0.0452），且caspase-3活性显著上升（P=0.0125和P=0.0231），见图 3。

2.4 MRE11通过调控AKT磷酸化水平来调节c-myc表达

与non-spe组比较，MRE11 si组Ec9706和TE-1细胞AKT磷酸化水平（P=0.0317和P=0.0172）和c-myc蛋白表达量（P=0.0258和P=0.0155）明显下降，见图 4A。与MRE11 si+0 μg/ml组比较，MRE11 si+1.5（P=0.0185和P=0.0206）、1.8（P=0.0197和P=0.0218）和2 μg/ml组（P=0.0161和P=0.0233）AKT磷酸化水平明显升高，MRE11 si+1.5（P=0.0162和P=0.0219）、1.8（P=0.0188和P=0.0235）和2 μg/ml组（P=0.0237和P=0.0162）c-myc蛋白表达量显著升高，见图 4B。与MRE11 si组比较，MRE11 si+1.5 μg/ml组Ec9706和TE-1细胞增殖显著上升（P=0.0124和P=0.0263），且细胞凋亡显著下降（P=0.0153和P=0.0245），见图 5。

2.5 MRE11通过调节c-myc表达影响食管鳞癌细胞增殖和凋亡

与MRE11 si+pc组比较，MRE11 si+c-myc组Ec9706和TE-1细胞中c-myc蛋白表达量显著升高（P=0.0147和P=0.0259），见图 6A，细胞增殖率显著升高（P=0.0165和P=0.0211），见图 6B，caspase-3活性显著降低（P=0.0207和P=0.0239），见图 6C。

3 讨论

食管鳞癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一，虽然根治性食管鳞癌切除术联合化疗的治疗方案已经普及，但由于大部分患者发现时已为晚期，5年生存率较低^[15-16]。降低细胞的增殖能力和诱导细胞凋亡将大大提高食管鳞癌的治疗效果^[17]。MRE11、RAD50和NBSl组成MRN复合物，对DNA损伤的感知和修复以及信号转导具有重要作用，在维持端粒、细胞周期检查点信号系统、DNA复制和DNA双链断裂过程中必不可少^[18-19]。Tuxworth等^[20]研究发现，MRE11可降低DNA损伤，抑制视网膜神经节细胞的凋亡。Yuan等^[10]表明MRE11高表达显著促进乳腺癌细胞的增殖并促进乳腺癌的发展。然而，Borde等^[21]报道显示MRE11具有抵抗癌症发生发展的重要作用。目前为止仍没有关于MRE11对食管鳞癌细胞增殖和凋亡作用的报道。本研究发现MRE11蛋白表达量在食管鳞癌细胞Ec9706和TE-1中显著上调。MRE11 siRNA转染食管鳞癌细胞下调MRE11的表达，有效促进细胞凋亡和caspase-3活性，并且抑制细胞增殖能力。

Fraser等^[11]研究表明MRE11可调控成纤维细胞AKT磷酸化水平。另外，Dominguez-Caceres等^[12]发现在淋巴细胞中AKT具有调节c-myc表达量的作用。AKT又称为蛋白激酶B（protein kinase B, PKB），是细胞增殖和凋亡的重要调控因子^[22]。有文献表明，AKT活化增强前列腺上皮细胞的增殖能力^[23]。在BRD4对胆囊癌细胞增殖和凋亡的作用中AKT也扮演了不可或缺的角色^[24]。Wang等^[25]研究发现抑制AKT活化具有促进骨肉瘤细胞凋亡的作用。癌基因c-Myc是一种转录因子，调节细胞生长、增殖、刺激细胞周期^[26]。Mahapatra等^[27]报道表明降低c-myc表达显著抑制黑色素瘤和卵巢癌细胞的增殖。干扰c-myc表达促进肺腺癌细胞凋亡^[28]。本研究结果显示，抑制MRE11表达明显降低AKT磷酸化和c-myc蛋白表达量，并且AKT激动剂SC79（1.5、1.8和2 μg/ml）显著逆转了下调MRE11对c-myc蛋白表达量的抑制作用。说明MRE11可通过调节AKT磷酸化水平来调控c-myc的表达量。目前，已有文献表明，下调c-myc表达量可抑制食管鳞癌细胞增殖并促进其凋亡^[29-30]。因此，抑制MRE11可通过AKT下调c-myc表达量，进而抑制食管鳞癌细胞增殖和促进其凋亡。

综上，MRE11在食管鳞癌细胞中表达量显著升高，下调其表达量明显抑制食管鳞癌细胞增殖且促进细胞凋亡。在食管鳞癌细胞中，干扰MRE11可抑制AKT磷酸化和c-myc的表达量。另外，MRE11通过AKT调节c-Myc的表达，从而实现对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用。

作者贡献：

张燕：设计与实施实验、收集与分析数据、撰写论文

张红蕊：指导数据分析和论文写作

孟丹丹、弋振营：指导实验

徐志巧：指导实验设计、修改和审核论文