0 引言

高危型HPV持续感染，是引起宫颈鳞状细胞癌的主要原因，有报道90%的女性一生中可能感染HPV，而10%女性发生持续性感染，仅1%的感染者最终转变为宫颈癌，这提示宫颈癌患者体内可能存在免疫抑制微环境，无法全面有效清除HPV^[1-2]。有研究报道PKCι蛋白激酶Cι（protein kinase Cι, PKCι）/Yes相关蛋白1（yes-associated protein 1, YAP1）参与肿瘤免疫微环境调节，PKCι通过下游效应因子YAP1促进免疫抑制，而YAP1通过募集骨髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）和CD8+T细胞促进肿瘤的免疫抑制，导致细胞毒性T细胞低浸润，而自然杀伤（natural killer, NK）细胞浸润减少^[3]。有文献报道PKCι/YAP1调节肿瘤免疫微环境，但未见PKCι/YAP1与HPV感染在宫颈癌局部免疫微环境中的作用报道^[4]，因此，本研究检测宫颈正常组织（normal cervical tissue, NCT）、低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions, LSIL）、高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesions, HSIL）及宫颈鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）高危型HPV的感染率，PKCι、YAPl、CD4以及CD8的蛋白表达，分析各组患者HPV感染率、PKCι、YAP1、CD4以及CD8蛋白表达之间的差异及其相关性以及临床病理特征，探讨宫颈癌变的局部免疫微环境的变化，为研究宫颈癌发病机制及诊治提供可能的策略。

1 资料与方法 1.1 资料

选择中南大学湘雅医学院附属海口医院2013年1月—2015年1月全子宫术后NCT、LSIL、HSIL及SCC组织学标本各80例，均未经抗肿瘤治疗，各组间年龄无明显差异。所有病例及实验结果均经高级病理医师阅片确认，其中NCT组为妇科肿瘤全子宫切除术后标本。所有试剂（盒）均来自上海信裕公司，按操作说明书进行，本研究经中南大学湘雅医学院附属海口医院伦理委员会审核批准，批准号：2018-（伦审）-173，伦理委员会批准免知情同意。

1.2 方法

各组患者的高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、69型）感染采用在我院就诊时检测的结果，根据检测报告结果计算各组病患高危型HPV的感染率。IHC二步法检测4组组织中PKCι、YAP1、CD4、CD8蛋白表达水平，兔抗PKCι抗体（批号：BJ07176986）、兔抗YAP1抗体（批号：AI08203707）、兔抗CD4抗体（批号：AI01301602）和兔抗CD8抗体（批号：BJ05096373）均购自北京博奥森生物技术有限公司。在光学显微镜下观察计数，根据阳性细胞百分比和着色强度判断，由两项计分相乘所得，0~1分为-，2~4分为+，5~8分为++，9~12分为+++。其中-为阴性组，+/++/+++为阳性组。两项计分分别为：根据阳性细胞百分比（即阳性细胞数占总细胞数的百分比）：< 5%为0分；≥5%~25%为1分；≥25%~50%为2分；≥50%~75%为3分；≥75%~100%为4分；根据细胞染色强度：细胞无显色为0分；浅棕黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分^[5]。

1.3 统计学方法

采用SPSS18.0软件处理，计数资料行χ²检验，采用n（%）表示，相关性分析采用Spearman分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组宫颈病变患者高危型HPV感染率及PKCι、YAP1、CD4、CD8阳性率比较

320份组织均完成HPV mRNA测定，结果表明：在NCT、LSIL、HSIL及SCC组织中高危型HPV感染率逐渐升高，PKCι、YAP1阳性率越高，CD4阳性率越低，CD8阳性率越高，差异有统计学意义（P < 0.05），见表 1、图 1。

2.2 宫颈病变严重程度与高危型HPV感染率、PKCι、YAP1、CD4以及CD8表达相关性分析

Spearman相关性分析结果表明，宫颈病变级别与高危型HPV感染（r=0.600, P=0.000）、PKCι（r=0.577, P=0.000）、YAP1（r=0.592, P=0.000）以及CD8阳性（r=0.0401, P=0.000）表达均呈正相关，与CD4阳性表达呈负相关（r=-0.458, P=0.000）。

2.3 SCC患者HPV感染与PKCι、YAP1、CD4及CD8表达的相关性

Spearman相关性分析结果表明，在SCC中HPV感染与PKCι、YAP1以及CD8阳性表达相互之间的均呈正相关（P < 0.05），而CD4阳性表达与HPV感染以及PKCι、YAP1、CD8阳性表达相互之间均呈负相关（P < 0.05），见表 2。

2.4 HPV、PKCι、YAP1、CD4及CD8与早期SCC临床病理特征的关系

HPV感染、PKCι、YAP1以及CD8阳性表达在SCC不同的分化程度以及有无脉管瘤栓之间差异均有统计学意义（P < 0.05），见表 3。

3 讨论

宫颈微环境免疫功能受阴道微生态系统、阴道黏膜免疫防御系统、局部微环境免疫细胞及细胞因子调节。任何一个环节发生异常，均有可能改变HPV感染引发宫颈上皮内瘤变以及宫颈癌发生发展的自然演变^[6]。免疫调节在HPV导致宫颈病变的过程中至关重要^[7]。T淋巴细胞和B淋巴细胞均参加了机体的抗肿瘤免疫反应，其中T淋巴细胞发挥主导作用。研究发现宫颈癌患者的CD4+T细胞百分比和CD4+/CD8+明显低于正常人群，提示宫颈局部细胞免疫与HPV的持续感染有着密切关系，持续的HPV感染破坏了宫颈局部细胞免疫微环境，CD4+和CD8+细胞平衡失调，导致宫颈病变的发生发展^[8-11]。本研究中，NCT、LSIL、HSIL以及SCC组织中高危型HPV感染率逐渐升高，CD4阳性表达率逐渐降低，CD4+与病变程度呈负相关，CD8阳性表达率逐渐升高，CD8+与病变程度呈正相关，而CD4与CD8阳性表达率之间呈负相关，说明宫颈癌患者HPV感染检出率最高，且常伴有细胞免疫功能异常，它们在疾病的发生发展中发挥了重要作用。

PKCι（又称为PRKCΙ）是一种非典型PKC（aPKC包括ζ、ι/λ），aPKC通过调控多条信号通路在组织器官的发育和稳态维持、肿瘤发生发展、免疫应答等过程中发挥重要作用。研究表明PKCι信号抑制剂抑制两种关键的致癌信号通路，由PKCι和KCζ驱动，以显著减少肿瘤的生长和转移，抑制非典型PKC信号是治疗肿瘤的一种很有前途的治疗策略^[12-13]。有研究表明，PKCι过表达塑造了肿瘤免疫抑制性微环境，导致S100、IL6/1b、CSF3、前列素内环氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2, PTGS2）及肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）等细胞因子过表达，而NK细胞浸润减少。另有研究显示，TNF-α具有抗癌和促癌双向作用，它的抗肿瘤机制是多方面的，目前发现主要有诱导凋亡、影响肿瘤血管系统和增强宿主免疫力三个方面。在卵巢癌细胞中，TNF-α上调炎性细胞因子及趋化因子网络，作用于卵巢癌微环境，影响肿瘤血管发展、癌细胞迁移等，从而促进肿瘤的发展及恶化^[3-4]。有研究显示PKCι通过YAP1促进免疫抑制，YAP1是肿瘤进展中的下游效应因子，YAP1通过募集骨髓来源的抑制性细胞和CD8+T细胞来促进肿瘤的免疫抑制，导致细胞毒性T细胞低浸润，PKCι/YAP1调节为高致死性恶性肿瘤提供了一种治疗策略^{[3, 14]}，见图 2。本研究结果表明：宫颈病变级别与高危型HPV感染率、PKCι和YAP1蛋白阳性表达、CD8浸润阳性表达呈正相关，与CD4浸润阳性表达呈负相关；在SCC中HPV感染与PKCι、YAP1及CD8阳性表达相互之间的均呈正相关，而CD4阳性表达与HPV感染及PKCι、YAP1、CD8阳性表达相互之间均呈负相关。本研究提示宫颈癌发生发展可能与HPV、PKCι和YAP1、CD4及CD8蛋白表达异常有关，同时可能存在协同作用。

综上所述，宫颈癌的发生发展与高危型HPV感染密切相关，同时伴随PKCι、YAP1蛋白表达异常，造成局部免疫微环境失衡，为研究宫颈癌的发病机制以及诊治提供可能的策略。

作者贡献

陈胜民：资料收集、实验操作、数据统计及论文撰写

王国平：资料收集、实验操作及数据统计

林志仁：实验操作及结果判读

袁峰：病例采集、实验操作、结果判读及论文撰写