2021, Vol. 48文章信息
- Slug通过下调CDH3/β-catenin/C-myc表达抑制宫颈癌细胞增殖
- Slug Inhibits Proliferation of Cervical Cancer Cells Through Down-regulating CDH3/β-catenin/C-myc Expression
- 肿瘤防治研究, 2021, 48(8): 751-756
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2021, 48(8): 751-756
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2021.21.0209
- 收稿日期: 2021-02-25
- 修回日期: 2021-05-31
引用本文 |
2. 710061 西安，西安交通大学医学部
2. Medical College of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China
在全球范围内，宫颈癌是仅次于乳腺癌、结直肠癌和肺癌的女性第四种常见肿瘤类型，严重威胁女性的健康和生命[1]。Slug又称为Snai2（snail family transcriptional repressor 2, Snail家族转录抑制因子2）, 是Snail锌指转录因子家族的一员，在细胞上皮-间充质转换（EMT）过程中发挥重要作用。目前的研究表明Slug可以促进多种类型肿瘤细胞的上皮-间充质转换过程，并兼具促进或抑制肿瘤细胞增殖的双重作用[2]。我们前期的研究发现，在宫颈癌细胞中，Slug可以降低Wnt/β-catenin信号转导通路活性，显著下调CDH3在宫颈癌细胞系SiHa中的表达[3]。CDH3又称为P-cadherin（cadherin 3, 钙黏蛋白3），是钙黏蛋白家族的一员。CDH3通过调节Wnt/β-catenin信号转导通路的活性，参与肿瘤细胞的增殖及肿瘤的生长[4]。但在宫颈癌中，关于Slug能否调节CDH3表达及Slug通过CDH3如何调节wnt/β-catenin信号转导通路活性的研究仍不多见。本研究通过检测Slug对CDH3启动子区的转录调节作用，探讨Slug通过转录抑制CDH3表达下调β-catenin和C-myc在SiHa细胞中的表达从而抑制细胞增殖的分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料宫颈癌细胞系SiHa和HeLa购自美国ATCC公司。CDH3表达载体3FLAG-SV40-EGFP-IRER购于上海吉凯基因公司，质粒表达载体pCAG-IRES2- AcVEC-neo由本实验室保存。DMEM培养基购于上海源培生物科技有限公司，胎牛血清购于以色列Biological Industries公司，Slug蛋白抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，CDH3、β-catenin、C-myc和GAPDH蛋白抗体均购于美国Santa Cruz公司，染色质免疫共沉淀试剂盒购于美国Millipore公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司，其余试剂为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人宫颈癌细胞SiHa和HeLa培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于5%CO2的37℃培养箱中进行常规培养。稳定表达Slug蛋白的SiHa细胞系SiHa-Slug（SiHa-Slug-2和SiHa-Slug-3）及其对照细胞SiHa-Vec（SiHa-Vec-2和SiHa-Vec-3）通过G418压力筛选获取，保存于本实验室[3]。在HeLa和SiHa-Slug细胞中通过脂质体瞬转CDH3表达载体3FLAG-SV40-EGFP-IRER，分别获得HeLa-NC、HeLa-CDH3和SiHa-Slug-CDH3细胞。
1.2.2 RNA提取及转录组测序使用TRIzol试剂盒（美国Invitrogen公司）提取SiHa-Vec（Vec2、Vec3和Vec5）和SiHa-Slug（Slug2、Slug3和Slug5）两组细胞的总RNA，之后将样本交于华大基因公司通过BGISEQ-500平台进行转录组测序，随后的数据通过华大基因公司的Dr.Tom在线系统进行分析。
1.2.3 Real-time PCR检测细胞mRNA表达通过Cancer Cell Line Encyclopedia数据库分析CDH3在HeLa和SiHa细胞中mRNA的表达。使用TRIzol试剂提取细胞的总RNA，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，以NCBI Gene bank提供的人基因序列为模板设计特异性Real-time PCR引物，见表 1。Real-time PCR按照SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书进行。将各管混匀离心后，置于Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪中进行扩增反应。每个样品准备3个复管，实验至少重复3遍。
对数生长期的细胞胰酶消化后制备成细胞悬液，接种于0.5 cm×0.5 cm的爬片上。细胞融合度达到70%左右后，依次进行下述步骤：PBS洗涤5min×3次，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤5 min×3次，加入0.2%TritonX-100，室温放置10 min，PBS洗涤5 min×3次，将细胞爬片粘在载玻片上滴加一抗，4℃湿盒过夜。次日，取出湿盒，室温放置30 min，PBS洗涤5 min×3次，滴加二抗，室温放置30 min，PBS洗涤5 min×3次，DAB显色，苏木素染色2 min，盐酸酒精分化15 s，氨水反蓝15 s，梯度酒精脱水各5 min，二甲苯透明2 min，中性树胶封片，光学显微镜下观察拍照。
1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖将细胞胰酶消化后制成单细胞悬液，以1000个/孔细胞浓度接种于96孔培养板中。接种后1、2、3、4、5 d，采用CCK-8法检测各组OD值。步骤如下：每孔加入10 μl CCK-8，5%CO2培养箱孵育2 h，吸弃上清液，于酶标仪上测定450 nm波长吸光度值，根据吸光度值绘制生长曲线，各实验组均设置3个复孔，实验重复3次。
1.2.6 细胞计数法检测细胞增殖将细胞胰酶消化后制备成单细胞悬液，按照4×104个/皿细胞的浓度接种于6孔板。接种后1、2、3、4、5 d，分别进行细胞计数。根据细胞计数结果绘制细胞生长曲线，每组实验设置3个复孔。实验重复3次。
1.2.7 Western blot实验收集处于对数生长期的细胞，加入细胞裂解液收集细胞蛋白，并测定各组细胞的蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白。转膜结束后，将膜于5%的脱脂奶粉（TBST缓冲液配置）中室温封闭1 h后加入一抗，4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜（10 min×4次），二抗室温孵育1 h后TBST洗膜（10 min×4次），然后用化学发光检测液进行发光反应，通过Western blot化学发光成像一体机（陕西鑫来博生物工程有限公司）拍照分析。
1.2.8 CDH3启动子区双荧光素酶报告系统实验通过使用UCSC在线数据库分析CDH3基因启动子区后，在其启动子区427 bp到-1483 bp的序列中发现了多个E-box（CANNTG）的特异序列。选择Promega公司的pGL3 Luciferase Reporter Vectors构建CDH3双荧光素酶报告载体，以MluⅠ和BglⅡ作为酶切位点，设计特异性引物，引物见表 2。构建包含CDH3启动子区不同E-box作用元件的双荧光素酶报告质粒。之后取对数生长期的各组细胞，0.25%胰酶消化重悬为单细胞悬液，以5×104个/孔细胞浓度接种于24孔板。将CDH3启动子区报告基因质粒与内参载体海参（pRL-TK）报告基因质粒按照LipofectamineTM 2000脂质体转染系统操作说明分别共转染于SiHa-Vec和SiHa-Slug细胞。转染48 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作说明检测荧光素酶活性：弃去24孔板中的培养基，加入PBS，轻轻洗涤细胞后弃去洗涤液，加入100 μl的1×PLB细胞裂解液裂解细胞，将细胞悬液移入1.5 ml EP管，待测。取待测样品20 μl加入EP管中，然后加入100 μl荧光素酶测试试剂LAR Ⅱ吹打混合后，放入发光检测仪中检测萤火虫荧光素酶活性，记录第一次发光值（FLU）。加入等体积的1×Stop & GloTM试剂，轻轻混匀，发光检测仪中检测Renilla荧光素酶活性，记录第二次发光值（RLU）。以FLU/RLU比值评估TOP/FOP-Flash报告基因的相对表达量。
按照染色质免疫共沉淀试剂盒说明书进行实验：在培养的细胞中加入37%甲醛，37℃孵育10 min，进行细胞的甲醛交联。后加入2 ml 10×甘氨酸终止交联。将细胞收集于1.5 ml离心管中，重悬于SDS裂解缓冲液中。将细胞裂解液在冰上进行超声破碎DNA，12 000 g，4℃离心10 min收集上清液，-80℃保存待用。在100 μl的超声破碎产物中，加入900 μl ChIP稀释缓冲液和20 μl的50×蛋白酶抑制剂Ⅱ，再加入60 μl G蛋白琼脂糖。4℃颠转混匀1 h，3000~5000 g离心1 min。收集上清液，留取20 μl做为阳性对照。分别加入5.0 μg Slug抗体、1.0 μg阴性对照和1.0 μg阳性对照，4℃摇床颠转过夜。过夜孵育后，按说明书步骤洗脱回收DNA样品。设计特异性引物，见表 1。以回收的DNA样品进行实时荧光定量PCR。PCR扩增反应条件如下：94℃，10 min；94℃，20 s，60℃，60 s，50循环。
1.3 统计学方法采用SPSS17.0进行数据的统计学分析，实验数据结果以均数±标准差（x±s）表示，多组样本间的均数比较采用单因素方差分析，两组样本间的均数比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Slug抑制CDH3在SiHa细胞中的表达转录组测序分析结果显示，同对照组（SiHa-Vec）相比，在SiHa-Slug细胞中，共检测到500个上调基因和294个下调基因，见图 1A。其中，CDH3表达在SiHa-Slug组中显著降低，见图 1B。Real-time PCR、Western blot和细胞免疫化学的结果显示，在SiHa细胞中过表达Slug可以下调CDH3的表达，见图 1C~E。
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| **: P < 0.01; Scale bar: 10 μm. A: the volcano plot of the differential genes in SiHa-Slug cells; B: the mRNA expression of CDH3 in SiHa-Vec and SiHa-Slug cells were detected by transcriptome sequencing analysis; C-E: the mRNA and protein levels of CDH3 in SiHa-Vec and SiHa-Slug cells were detected by Real-time PCR(C), Western blot(D) and immunocytochemistry (E, ×100), respectively. 图 1 Slug抑制CDH3在SiHa细胞中的表达 Figure 1 Slug inhibited CDH3 expression in SiHa cells |
Cancer Cell Line Encyclopedia数据库的结果显示CDH3在HeLa细胞中低表达，见图 2A。Western blot和细胞免疫化学的结果显示，CDH3在HeLa细胞中低表达，在SiHa细胞中的表达高于HeLa细胞，见图 2B~C。在HeLa细胞中瞬转CDH3后，可以上调CDH3、β-catenin和C-myc在HeLa细胞中的表达（P < 0.05），见图 2D。细胞计数和CCK-8实验表明，在HeLa细胞中上调CDH3表达后可以促进HeLa细胞的增殖（P=0.0337, P=0.0010），见图 2E~F。
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| *: P < 0.05, **: P < 0.01; Scale bar: 10 μm. A: the mRNA level of CDH3 in SiHa and HeLa cells from Cancer Cell Line Encyclopedia database; B, C: the protein levels of CDH3 in HeLa and SiHa cells were detected by Western blot (B) and immunocytochemistry (C, ×100), respectively; D: the expression of CDH3, β-catenin, and C-myc in HeLa cells with transient transfection of CDH3 expression vector were detected by Western blot; E, F: the proliferation of HeLa-CDH3 cells were detected by growth curves (E) and CCK-8(F), respectively. 图 2 CDH3促进HeLa细胞的增殖 Figure 2 CDH3 promoted proliferation of HeLa cells |
在SiHa-Slug细胞中挽救CDH3表达后，可以显著上调CDH3、β-catenin和C-myc蛋白的表达（P < 0.05），见图 3A。细胞计数和CCK-8实验表明，挽救CDH3表达可以恢复SiHa-Slug细胞的增殖活力（P=0.0024, P=0.0032），见图 3B~C。双荧光素酶报告系统和染色质免疫共沉淀实验结果显示Slug可以识别并结合于CDH3启动子区的E-box，从而转录抑制CDH3表达，见图 3D~E。
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| *: P < 0.05; A: the expression of CDH3, β-catenin and C-myc in CDH3 rescued SiHa-Slug cells were detected by Western blot; B, C: the proliferation of SiHa-Slug and SiHa-Slug-CDH3 cells were detected by growth curves (B) and CCK-8 (C), respectively; D: the activity of CDH3 promoter was measured by dual luciferase assay and was presented as the fold change in the activity of SiHa-Slug cells versus SiHa-Vec cells; E: a quantitative ChIP assay of the CDH3 promoter region in SiHa-Slug and SiHa-Vec cells. 图 3 Slug在SiHa细胞中转录抑制CDH3表达 Figure 3 Slug transcription inhibited CDH3 expression in SiHa cells |
Slug被认为参与多种肿瘤细胞的生理过程，促进多种肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，增加肿瘤发生转移的风险[5]。Slug可以促进肺癌及成胶质细胞瘤的增殖，但也可以抑制前列腺癌细胞和人表皮角质形成细胞的增殖[6]。我们前期的研究发现，Slug通过抑制Wnt/β-catenin信号转导通路的活性可以抑制宫颈癌细胞的增殖和肿瘤生长[6]。在本研究中，RNA-sequence测序的结果提示Slug表达可以显著抑制CDH3在SiHa细胞中的表达。CDH3（P-cadherin）最早于1986年在发育中的小鼠胚胎中发现[7]。与钙黏蛋白家族的其他成员类似，CDH3在细胞的生长和迁移过程中发挥重要作用。但是CDH3在不同类型肿瘤的发生及发展过程中呈现不同的作用[4]。有研究表明CDH3可以促进胃癌、胰腺癌及乳腺癌等肿瘤的发生，相反的，在肝细胞癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤中，CDH3抑制肿瘤的发生[8-10]。通过调节Wnt/β-catenin信号转导通路的活性，CDH3可以参与调节多种肿瘤细胞的增殖及肿瘤的生长[11]。本研究证实了在SiHa细胞中过表达Slug可以显著抑制CDH3的表达。因此，我们推测在宫颈癌中，Slug是否可以通过CDH3调节Wnt/β-catenin信号转导通路的活性。
Cancer Cell Line Encyclopedia数据库的结果显示，CDH3 mRNA水平在HeLa细胞中低于SiHa细胞。Western blot和细胞免疫化学的结果也证实CDH3的表达在SiHa细胞中高于HeLa细胞。因此，为了进一步研究CDH3在宫颈癌细胞中的作用，在HeLa细胞中通过瞬转CDH3表达载体上调了CDH3蛋白水平，细胞计数和CCK-8的结果显示CDH3可以促进HeLa细胞的增殖。Western blot的结果证实，在HeLa细胞中瞬转CDH3表达载体后可以上调β-catenin及其下游分子C-myc的表达。此外，在Slug过表达的SiHa细胞中通过瞬转CDH3表达载体挽救CDH3表达后，也可以上调β-catenin及其下游分子C-myc的表达，并恢复细胞的增殖能力。目前的研究也证实，C-myc可以促进多种肿瘤细胞的增殖[12]。因此，我们推测，Slug通过抑制CDH3的转录，可以下调β-catenin及其下游分子C-myc的表达，从而抑制宫颈癌细胞的增殖。
Slug通过识别并结合于目的基因启动子区的E-box（CANNTG）作用元件转录抑制目的基因的表达[5]。通过UCSC在线数据库分析CDH3基因启动子区，发现在其启动子区427 bp到-1483 bp的序列中包含多个E-box（CANNTG）特异序列。包括有：CACCTG（P7, P6), CAGATG（P5）, CACTTG（P2, P4）, CAGGTG（P3, P1）。本研究结果表明，和SiHa-Vec相比，荧光素酶报告载体P5和P3的酶活性都出现了不同程度的下降。此外，染色质免疫共沉淀（ChIP）的结果显示，在SiHa-Slug细胞中，Slug同P3和P5位的E-box（CANNTG）有不同程度的结合。以上结果表明Slug可以特异性的识别并且结合于CDH3启动子区的E-box，转录抑制CDH3的表达。综上所述，Slug通过转录抑制CDH3的表达，可以下调β-catenin及其下游分子C-myc的表达，从而抑制宫颈癌细胞的增殖。
作者贡献：
刘宪、崔南：设计实验、撰写及修改论文
张燕茹、冯倩：实验实施、采集数据、统计分析
陈茜、王海燕：分析和解释数据
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