0 引言

横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma, RMS）是一种来源于骨骼肌肉的高度侵袭性的软组织肉瘤，在儿童及青少年中多见^[1]。尽管包括手术、化疗和放疗在内的综合治疗使中、低度风险RMS患者的5年生存率增加至约60%，但高风险RMS患者的预后仍不乐观^[2]，迫切需要更好的预后指标和治疗靶点。乏氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）在各种细胞中普遍表达，是正常和癌组织中缺氧反应的关键调节因子，其特定的负性转变机制正逐渐被阐明，并且作为潜在的抗癌药物靶点已经引起越来越多的关注^[3]。组蛋白去甲基化酶JMJD2B是HIF-1α的下游靶点，其特征在于催化JmjC结构域^[4]，研究显示高表达的JMJD2B在肿瘤细胞的增殖、侵袭与迁移中发挥着重要作用^[5]。本研究通过检测JMJD2B和HIF-1α在RMS组织中的表达情况，探讨JMJD2B和HIF-1α在RMS患者预后中的临床意义。

1 资料与方法 1.1 临床资料

收集河北医科大学第四医院病理科2012年1月—2014年12月确诊的RMS石蜡组织标本78例。同时收集患者的性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、危险度、治疗方案、肿瘤转移、肿瘤分期等临床病理资料。本研究获得患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法

所有标本经3.7%中性甲醛液固定，石蜡包埋，以4 µm厚度连续切片，HE染色。切片脱蜡水化后高压修复15 min滴加一抗，置4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗后滴加二抗，室温孵育20 min。显色3~5 min，HE对比染色，固定。所用抗体包括兔抗人HIF-1α（Abcam公司，抗体编号ABP51513，稀释度1:100），兔抗人JMJD2B抗体（Abcam公司，抗体编号A301-478A，稀释度1:100）。

1.2.2 免疫组织化学法结果判定

所有病理切片由2位资深病理科专家分别判读。于每张切片中挑选染色均匀5个不相邻高倍视野（×400）测定免疫阳性细胞百分比。阳性标记为棕黄色颗粒，且JMJD2B和HIF-1α阳性表达均定位于细胞核。根据染色程度评价染色强度：染色阴性计0分，轻度染色计1分，中度染色计2分，强染色计3分；根据切片中阳性细胞百分比评分：无阳性细胞计0分，≤25%计1分，25%~50%计2分，> 50%~100%计3分。最后总评分=阳性强度评分×阳性百分比评分。0~3分为阴性（-）；4~9为阳性（+++）^[6]。

1.2.3 实时定量PCR

将已切片的标本组织，置入2.0 ml消毒离心管中；经脱蜡水化后加入细胞裂解液和蛋白酶K，55℃过夜，待组织溶解完全后用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）提取RNA。我们设计了GAPDH和JMJD2B的特异性引物，见表 1。按照制造商的说明，使用LightCycler 480系统进行PCR实验。不添加UNG的50%SYBR GREEN通用PCR预混液（Applied Biosystems公司），正向和反向转录引物各50 nmol/L，反转录cDNA 2 μl。并设置扩增条件为95℃下5 min，然后进行45个循环，每个循环包括95℃下10 s，55℃下1 min和72℃下10 s。将反应物在95℃加热15 s，在65℃加热1 min以绘制熔解曲线，冷却至50℃持续10 s。

1.2.4 随访

所有病例采用定期门诊或电话随访。总生存期（overall survival, OS）定义为从确诊RMS至死亡或末次随访日期的时间间隔。随访截至2020年1月。

1.3 统计学方法

所有数据均采用SPSS21.0软件进行分析。组间比较采用独立样本t检验和χ²检验，相关性验证采用Spearman相关分析，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线、Log rank检验及Cox回归分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 临床病理特征

78例RMS患者中女性41例，男性37例。年龄范围5~45岁，中位年龄8岁。生存时间范围6~95月，中位生存时间61月。死亡32例，死亡原因均为肿瘤。具体各临床病理参数见表 2。

2.2 JMJD2B和HIF-1α的表达与RMS患者临床病理特征的关系

78例RMS患者JMJD2B和HIF-1α表达阳性例数分别为46例（59.0%）和44例（56.4%），二者在RMS患者组织中的表达均高于阴性对照组（均P < 0.05），见图 1。统计学显示JMJD2B和HIF-1α的表达水平与危险度级别、是否接受新辅助化疗、有无远处转移、肿瘤分期有关（均P < 0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤直径、组织学分型无关（均P > 0.05），见表 2。

2.3 JMJD2B和HIF-1α的表达相关性

Spearman相关性分析显示JMJD2B和HIF-1α表达呈显著正相关（P < 0.001, r=0.518），见表 3。

2.4 JMJD2B mRNA表达水平验证

实时定量PCR实验显示蛋白表达阳性组的JMJD2B mRNA表达水平显著高于阴性组（P < 0.001），见图 2。

2.5 JMJD2B和HIF-1α的相关生存分析

Kaplan-Meier生存曲线显示较高的危险度（P < 0.001）、未接受新辅助化疗（P=0.009）、HIF-1α（P=0.009）和JMJD2B（P < 0.001）的高表达与较短的OS显著相关，见图 3。单因素Cox回归显示危险度的级别、新辅助化疗的有无、HIF-1α和JMJD2B表达水平的高低可以影响RMS患者的临床预后（均P < 0.05），见表 4。进一步采用多因素Cox回归显示JMJD2B和危险度可作为RMS独立的预后因素，见表 5。JMJD2B高表达的RMS患者死亡风险增加。

3 讨论

缺氧是实体瘤的常见特征，不仅在肿瘤发生中具有重要作用，还与转移风险增加及不良临床预后相关^[7]。而作为缺氧反应的关键因子，HIF-1α通过调节糖酵解及相关辅助基因，帮助细胞适应缺氧环境并促进其恶性转变^[8]。在本研究中，我们证实了HIF-1α在RMS组织中高表达并与低OS显著相关，这与先前的发现一致，即HIF-1α在其他类型癌症中的高表达会促进肿瘤恶化，与患者的不良预后相关^[9]。这一作用可能与HIF-1α参与包括Akt、NF-κB、Wnt在内的多条信号通路有关，同时也为HIF-1α成为癌症患者潜在新型预后检测及治疗靶点提供了有力证据^[10-11]。

作为HIF-1α下游靶点，JMJD2B被发现启动子序列中含有HIF-1α结合位点^[12]。本试验也证实了HIF-1α和JMJD2B表达的正相关性。国外已有研究证明JMJD2B在癌症中高表达并导致不良临床预后^[13-14]，相关作用机制正被逐渐揭示。最新研究显示，JMJD2B的外源表达以p53依赖的方式增强了结肠癌细胞的皮下肿瘤生长^[15]。此外在骨肉瘤中，JMJD2B可能通过上调成纤维细胞生长因子2的表达水平，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭^[16]。本研究发现JMJD2B和HIF-1α的高表达与高危组别、未接受新辅助化疗、肿瘤远处转移和高级别分期等不良临床病理变量显著相关。同时，JMJD2B和HIF-1α的高表达与OS的缩短显著相关，但经多因素Cox回归分析，只有JMJD2B是独立的预后指标。这些表明了JMJD2B和HIF-1α可能是RMS病程中影响预后的重要因素。JMJD2B可能是一种新的RMS预后标志物。然而JMJD2B和HIF-1α在RMS中的具体调控机制仍有待阐明。

本研究具有局限性。首先，免疫组织化学分析是半定量的，进一步探讨需要完善定量实验方法。其次，样本量较小，我们的结论应该在更大的样本中得到验证。

综上所述，JMJD2B和HIF-1α在RMS组织中高表达，并与不良临床病理特征和不良预后有关。JMJD2B可作为RMS患者临床预后的新指标。

作者贡献：

吴宏增：研究设计和操作、论文撰写

赵嘉政：研究操作、统计分析

赵祎、马晓伟：数据汇总、文献查阅

冯和林：研究设计和操作过程中的指导