肿瘤防治研究  2021, Vol. 48 Issue (5): 484-488
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引用本文 |
乳腺癌是一种严重威胁妇女健康的世界性疾病，死亡率仅次于肺癌，位居恶性肿瘤第二位[1]。2020年，美国新确诊乳腺癌约27万例，4.2万例乳腺癌患者死亡[2]。在所有乳腺癌中，三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）是一种特殊类型，TNBC约占所有乳腺癌的16%，确诊后5年生存率明显低于其他类型乳腺癌患者[3]。TNBC一旦发生转移，对化疗的敏感度显著降低，中位生存时间缩短至6月以下[4]。TNBC较其他乳腺癌具有更强的侵袭性和转移性，术后3年复发率和5年死亡率均较高[5-6]。由于缺乏ER、PR和HER-2表达，对其他类型乳腺癌治疗有效的药物通常对TNBC无效[7]。肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes, Tils）主要存在于肿瘤微环境，主要由异质性淋巴细胞构成，在多种实体瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用，尤其是CD8+Tils细胞数量减少和免疫失活关系密切[8]。近年来，CD8+Tils与免疫治疗的疗效关系研究成为热点，但结论尚不明确。在TNBC中，CD8+Tils相关研究较少，也无针对性的表达情况及疗效预后分析，本研究拟探讨CD8+Tils在TNBC患者中的表达情况及其与新辅助化疗疗效的关系。
1 资料与方法 1.1 病例资料本研究回顾性分析2013年6月—2019年6月在河南大学肿瘤医院接受手术治疗的126例三阴性乳腺癌患者临床病理资料，术前均行新辅助化疗。本研究经我院医学伦理委员会批准（批号：2019-12-017-K06）。因本研究为回顾性分析，仅采集患者临床病理资料，不涉及干预患者治疗方案，不会对患者生理带来任何风险，且最终数据不会泄露任何个人隐私，已申请免除知情同意。
纳入标准：（1）病理明确诊断为乳腺癌且免疫组织化学ER（-）、PR（-）、HER2（-），若免疫组织化学HER2为（+）或（++），须经FISH检测为未扩增；（2）临床分期为Ⅱ~Ⅲ期；（3）均为女性患者；（4）年龄18~75岁；（5）PS评分0~2分；（6）术前完成4~6周期新辅助化疗后，再行手术治疗；（7）术后标本或组织保存完整。排除标准：（1）病例资料不完整，缺乏必要的检查化验结果，例如心、肝、肾检查化验指标，术前肿瘤影像学评估不完善者；（2）术前穿刺组织或术后标本肿瘤组织过少，无法再行相关免疫组织化学检测；（3）研究者认为应该排除的患者，主要包括病史资料记录不完整、术后随访记录不完全或缺失、术前临床分期有误、无法判断是否真绝经等。
1.2 试剂与检测即用型CD8兔抗人单克隆抗体购自福州迈新公司。所有标本均经福尔马林固定，常规石蜡包埋，2 μm连续切片，烘干机烘烤，并经二甲苯、梯度酒精、蒸馏水脱蜡，使用3%H2O2封闭内源性过氧化酶，后加入兔抗人CD8单克隆抗体，置于37℃培养箱内1 h；PBS冲洗后滴加二抗，室温孵育20 min；DAB显色，苏木精对比染色，盐酸酒精分化、脱水、透明、封片、显微镜下观察。操作步骤严格按产品说明书（MaxVision试剂盒KIT-5030）进行，以PBS代替一抗作为阴性对照，以慢性扁桃腺炎组织作CD8的阳性对照。
1.3 结果判定CD8+Tils密度计算：CD8+Tils阳性着色均定位于细胞膜，呈淡黄色至棕褐色粗颗粒。于低倍镜下观察整张切片，选取CD8+Tils细胞丰富的5个高倍视野（×400）计算其阳性细胞比例，取平均值。阳性细胞比例 < 10%为低表达、10%~40%为中表达、≥40%~90%为高表达。根据CD8+Tils表达中位值将患者分为低密度组和高密度组[9]，本研究Cut-off值为10%，即CD8+Tils表达比例 < 10%为低密度，记为（-）；≥10%为高密度，记为（+）。
1.4 随访通过病历或电话随访获得患者术后病理情况、生存状况、无病生存时间（disease-free survival, DFS）。随访日期截至2020年6月30日。DFS定义为自术后第1天至肿瘤复发或任何原因死亡或至随访截止日期的生存时间。
1.5 统计学方法采用SPSS26和R软件进行数据分析。计数资料采用χ2检验，Kaplan-Meier法进行生存分析，并行Log rank检验。将DFS作为因变量，年龄、分级、月经状况、病理分期、淋巴结转移、Ki-67指数、PS评分、肿瘤大小、脉管受侵、手术方式、新辅助化疗方案等作为自变量进行Cox单因素、多因素分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CD8+Tils的表达情况与入组患者临床资料特征的关系CD8+Tils表达高密度有45例（35.7%），具体情况见表 1。
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46例患者术后病理完全缓解（pathological complete remission, pCR）。将126例患者根据CD8+Tils表达情况分为高密度组（n=45）和低密度组（n=81），高密度组有30例（66.7%）达pCR，低密度组有16例（19.8%）达pCR，两组pCR率差异有统计学意义（χ2=27.467, P=0.000），见图 1~2。
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| LDG: Low-density group; HDG: high-density group. 图 1 高低密度CD8+Tils组pCR率对比 Figure 1 Comparison of pCR rates between high- and low- density CD8+Tils groups |
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| A: high-density infiltration of CD8+Tils, and pale yellow or tan coarse particles showed positive staining of CD8+TiLs; B: low-density infiltration of CD8+Tils, and pale yellow or tan coarse particles with positive staining of CD8+Tils were rarely seen. 图 2 三阴性乳腺癌组织高低密度组CD8+Tils的表达 Figure 2 Expression of CD8+Tils in high- and low- density groups of triple negative breast cancer tissue |
截至随访日期，79例因复发或转移达到DFS事件终点（其中35例生存），14例因非本病原因死亡，33例处于无复发生存状态。CD8+Tils高密度浸润患者中位DFS为49.0月（95%CI: 37.2~60.8），与CD8+Tils低密度浸润患者DFS 25.0月（95%CI: 20.0~30.0）比较，差异有统计学意义（χ2=18.480, P=0.000），见图 3。
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| 图 3 CD8+Tils浸润密度对三阴性乳腺癌患者DFS的影响 Figure 3 Effects of CD8+TiLs infiltration densities on DFS of TNBC patients |
单因素分析结果显示：年龄、病理分级、肿瘤大小、淋巴结转移、脉管侵犯与预后密切相关（P < 0.05）。将上述单因素分析有意义的变量纳入多因素分析，另外结合临床实际情况，将单因素分析无意义的CD8+Tils强制纳入多因素分析，结果显示病理高分级、肿瘤 > 2 cm、淋巴结转移（+）、脉管侵犯（+）、CD8+Tils低密度表达均为长期生存的不良影响因素（P < 0.05）。另外CD8+Tils为独立预后因素，肿瘤组织高密度表达者，预后良好，HR为0.52，降低进展风险48%，见表 2。
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目前虽然乳腺癌整体治疗效果及生存预后较之前有很大提高，但TNBC改善并不明显，治疗手段也较为有限[10]。对于局部晚期乳腺癌患者，尤其是TNBC患者，新辅助化疗是一种重要治疗手段，新辅助治疗的主要目的是提高治愈率[11]，降低术后复发。研究表明，对TNBC患者，新辅助治疗后病理完全缓解的患者生存率明显提高[12]。但新辅助化疗达到pCR的患者比例较低（20%~40%），因此，迫切需要探索TNBC患者新辅助化疗疗效有意义的生物标志物。
近年来，随着免疫治疗的兴起，对免疫标志物的探索也成为热点，Tils曾被认为是免疫治疗有效的生物标志物，还有多项研究[13-15]表明，Tils尤其是CD8+高度浸润与多种上皮肿瘤患者的长期预后相关，但尚缺乏在TNBC中的研究。Liu等[16]研究表明CD8+淋巴细胞浸润可能与基底细胞乳腺癌预后相关。但基底细胞乳腺癌并不等同于TNBC，目前如何分型基底细胞乳腺癌尚存困难，难以在临床推广。本研究入组126例TNBC患者，检测患者肿瘤组织的CD8+Tils浸润程度，根据平均阳性细胞表达程度，以10%为界，分为低密度组和高密度组。结果显示，CD8+Tils高密度浸润与年龄 < 60岁、病理高分级、临床高分期有关，具有统计学差异（P < 0.05）。
在CD8+Tils浸润与疗效预后方面，国内外在其他实体瘤方面进行了一些研究。林晶等[17]研究显示CD8+T细胞浸润程度越高，胃癌患者预后越好。卢慧敏等[18]研究显示CD8+T细胞高浸润是结直肠癌的独立预后因素，浸润程度越高，预后越好。本研究观察了不同浸润密度与TNBC患者术后pCR的关系，结果显示高密度CD8+Tils浸润者术后pCR率明显高于低密度组（66.7% vs. 19.8%, P=0.000），这与de Groot等[19]研究结果一致。另外，本研究还观察了不同CD8+浸润密度导致的术后DFS差异，CD8+Tils高密度浸润患者中位DFS为49.0月（95%CI: 37.2~60.8），较CD8+Tils低密度浸润患者（DFS: 25.0月，95%CI: 20.0~30.0）有明显统计学差异（P < 0.05）。初步证实CD8+Tils可能是TNBC患者疗效及预后的有效指标。
本研究采用Cox分析对临床各项指标以及CD8+Tils浸润与预后关系进行研究，多因素分析结果表明病理高分级、肿瘤 > 2 cm、淋巴结转移（+）、脉管侵犯（+）、CD8+TiLs低密度浸润均为长期生存的不良影响因素，且差异有统计学意义。另外CD8+Tils为TNBC独立预后因素，这与Liu等[16]研究结果一致，肿瘤组织高密度表达者，预后良好，HR为0.52，降低DFS进展风险48%。
本研究具有潜在局限性：针对CD8+TiLs浸润密度评估并没有一个客观标准，不同的病理中心可能有较大差异。另外由于三阴性乳腺癌发病率较低，能够行术前新辅助化疗的患者较少，而符合本研究入组条件的合格病例更少，因此入组患者跨度较长，有可能对最终研究结果造成偏倚。而且因为组织样本的局限性，本研究无法观察化疗前后CD8+Tils浸润情况的变化，尚需要进一步开展前瞻性随机试验评估化疗对肿瘤组织Tils浸润变化情况的影响。
作者贡献：
孔天东：论文撰写
陈露：文献搜集及试验数据整理统计
段方方、王留晏、周寒丽：病例资料筛选及随访登记
赵晓丽：部分随访登记
刘萌萌：实验实施
刘丹娜：数据统计分析及论文审校
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表1(Table 1)
