0 引言

肺癌是癌症死亡的主要原因，占所有癌症相关死亡的20%^[1]。化学疗法可在一定程度上提高生存率，但由于侵袭性肿瘤的复发，总体生存率较低^[2]。癌症干细胞（cancer stem cell, CSC）占总癌细胞群的一小部分，具有很强的致癌特性^[3]。CSC的特征是自我更新、分化、致瘤性和对化疗的耐药性^[4-5]。肺癌中的CSC标记包括代谢标记醛脱氢酶同工型1（ALDH1）和表面标记CD133、CD44和CD166 ^[6]。

知母皂苷（Timosaponin, TMS）作为传统中药知母的主要成分之一，具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗老年痴呆、保护脑缺血损伤及降糖等作用。近年来，其抗肿瘤活性逐渐被引起重视，对胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌及肺癌等细胞增殖均具有一定的抑制作用，可通过作用于丝裂原活化蛋白激酶、血管内皮生长因子及IL-18等发挥抗肿瘤活性^[7-8]，其多靶点抗肿瘤机制，为其开发成为新型抗肿瘤药物提供可能。本研究基于其抗肺癌作用，探讨其对CSC的影响及具体作用机制，进一步明确其多靶点抗肿瘤机制。

1 材料与方法 1.1 TMS制备、细胞培养及成球实验

TMS的制备采用70%乙醇为提取溶剂，回流提取2 h，以等体积饱和正丁醇萃取至皂苷显色为阴性，合并有机层，挥干溶剂后，以标准曲线法测得知母皂苷的含量，以总皂苷摩尔浓度给药。

人肺癌A549细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI培养基中。为了形成肺肿瘤球，将5×10⁴个A549细胞装在有Cancer Stem Premium培养基（ProMab Biotechnologies Inc., Richmond, CA, USA）的超低黏附平板中，并于37℃、5%CO₂培养箱中培养7天。使用NICE程序估算肿瘤球的数量。通过确定肿瘤球形成效率（TFE）（%）来估计肿瘤球的形成。

1.2 抗体和siRNA

抗GLI1、抗GLI2、抗Smoothened（SMO）和抗SOX2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。抗肌动蛋白抗体获自美国Santa Cruz Biotechnology公司。抗CD44 FITC和抗CD24 PE抗体获自美国BD Pharmingen公司。人SMO和SOX2特异的siRNA获自韩国Bioneer公司。

1.3 MTS法检测细胞增殖

将肺癌A549细胞以2×104个/毫升的密度接种于96孔板，37℃孵育过夜至细胞完全贴壁后，加入不同浓度的TMS，共培养48 h后，使用CellTiter 96 ® Aqueous One Solution细胞试剂盒评估肿瘤细胞增殖^[9]，并使用酶标仪于OD₄₉₀下测量。

1.4 平板克隆形成和迁移实验

对于平板克隆形成实验，将A549细胞以每孔1 000个接种于6孔板中，与TMS共孵育7天并计数。为了进行迁移测定，将细胞以2×10⁵个/毫升的密度接种于24孔板中培养过夜，至细胞贴壁后，使用移液管吸头进行刮擦，RPMI/10%FBS洗涤后，以TMS处理肺癌细胞，于显微镜下拍照^[10]。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

将肺癌细胞与TMS（20 mol/L）在6孔板中培养。根据说明书，通过Annexin V/PI染色检测凋亡细胞，样品通过Accuri C6进行细胞凋亡分析。

1.6 Hoechst染色和ALDEFLUOR分析

将A549细胞用30 mol/L的TMS处理1天，然后将其与Hoechst 33342溶液（10 mg/ml）在37℃下孵育30 min，用荧光显微镜观察对凋亡小体的影响。ALDEFUORTM测定试剂盒测定醛脱氢酶活性，根据说明书操作，将细胞在乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase, ALDH）测定缓冲液中于37℃培养30 min，使用Accuri C6对ALDH阳性细胞进行计数。

1.7 RT-qPCR检测基因表达

提取和纯化来自癌细胞的总RNA，按试剂盒操作测定RT-qPCR，其引物序列，见表 1。

1.8 Western blot检测蛋白表达

从肺癌细胞和肿瘤球中提取总蛋白，使用12%SDS-PAGE进行电泳分析后，将其转移至PVDF膜，在Odyssey封闭缓冲液中孵育1 h，然后分别与一抗孵育后，Odyssey缓冲液洗涤3次后与二抗孵育。使用Odyssey CLx系统进行图像分析。

1.9 检测Caspase-3/7活性

将A549细胞与TMS（40和80 mol/L）共孵育，Caspase-Glo 3/7试剂盒测定Caspase-3/7活性。按试剂盒说明操作，将100 μl的Caspase-Glo 3/7试剂添加到96孔板中并孵育，并用GloMax^® Explorer光度计测量活性。

1.10 siRNA转染

为了验证SOX2和SMO对肿瘤球形成的影响，用人SOX2和SMO siRNA转染A549细胞。根据说明书要求进行转染，使用Lipofectamine 3000温育和转染癌细胞。通过Western blot确定SOX2和SMO的蛋白质水平。

1.11 异种移植瘤实验

实验流程参照文献报道^[11]，雄性裸鼠（4周龄）购自上海斯莱克公司，并在小鼠设施中放置1周后进行实验。十二只雄性裸鼠于右背部皮下注射5×10⁶个/毫升的A549细胞，取TMS溶于DMSO中并以0.9%氯化钠溶液稀释，每天10 mg/kg腹腔注射给药，对照组给予相同量的0.9%氯化钠溶液，给药55天后计算肿瘤体积，计算公式为：肿瘤体积=（宽²×长度）/ 2。

1.12 统计学方法

所有数据均使用GraphPad Prism 5.0进行统计分析。所有数据均以平均值±标准差表示，单因素方差对数据进行分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 TMS抑制A549肺癌细胞增殖并诱导其凋亡

通过评估TMS对A549人肺癌细胞生长的影响，发现TMS具有显著抗肿瘤细胞增殖活性（P < 0.05），见图 1A。TMS可诱导凋亡小体的形成，见图 1B，进而诱导A549的细胞凋亡，见图 1C。TMS可增加A549细胞中caspase 3/7的活性（P < 0.05），见图 1D，抑制肺癌细胞的迁移和克隆形成（P < 0.05），见图 1E~1F。研究表明，TMS可有效抑制肺癌细胞的生长、凋亡、细胞迁移和克隆形成。

2.2 TMS对异种移植瘤的影响

测定TMS对异种移植瘤裸鼠模型中肿瘤生长的影响，对照组和TMS治疗组的裸鼠体重相似，见图 2A。经TMS治疗的裸鼠的肿瘤重量及肿瘤体积显著低于对照组（P < 0.0001），见图 2B~2C，表明TMS可显著抑制裸鼠模型中的肺癌细胞生长。

2.3 TMS对CSC的影响

为检测TMS是否抑制肺癌细胞中肿瘤球的形成，用不同浓度TMS作用于A549细胞肿瘤球，TMS可显著抑制肺肿瘤球的形成（P < 0.05），见图 3A。通过检测TMS对肺癌CSC标志物ALDH1水平的影响，发现TMS可将ALDH1阳性细胞分数从5.0%降低至2.5%，见图 3B，结果表明TMS能抑制肿瘤球的形成。

2.4 TMS通过抑制Hedgehog信号抑制肿瘤球形成

在TMS作用下，GLI1和GLI2的转录水平显著降低，而GLI3并未降低，TMS可降低GLI1、GLI2和SMO蛋白表达水平，见图 4A。为了进一步验证SMO在肿瘤球形成中的功能，考察SMO siRNA沉默后，细胞的肿瘤球形成能力，SMO特异性siRNA转染的肺癌细胞的肿瘤球形成减少了40%（P < 0.05），见图 4B，表明SMO和Hedgehog信号对于肺癌的肿瘤球形成至关重要。

2.5 TMS通过GLI介导调控SOX2抑制肿瘤球形成

由于GLI1介导的SOX2调控可调节肺和黑色素瘤CSC的自我更新，因此推测TMS可能对SOX2的表达具有调控作用。通过实验发现，TMS可显著降低SOX2的转录和蛋白表达水平（P < 0.05），见图 5A。为了明确Hedgehog信号对SOX2基因的调控，使用SMO基因的siRNA敲低SMO基因并检测SOX2转录，SMO可显著调节SOX2基因表达（P < 0.05），见图 5A。为了研究SOX2在肿瘤球形成中的功能，通过对SOX2进行siRNA沉默，发现用SOX2特异性siRNASOX转染的肺癌细胞的肿瘤球形成减少了70%（P < 0.05），见图 5B。结果表明，TMS可降低SOX2和Hedgehog信号转导，严重影响肺癌肿瘤球的形成。

2.6 TMS抑制肿瘤干细胞标记的基因表达和肿瘤球的生长

通过检测CSC特异性基因的转录水平，明确TMS是否通过抑制CSC特异性基因发挥作用。TMS可显著降低CSC中特定基因SOX2、Nanog、c-Myc和Snail的转录水平（P < 0.05），见图 6A。向肿瘤球培养基中加入TMS并培养来自肿瘤球的癌细胞，发现TMS可诱导肿瘤球的细胞死亡，见图 6B。

3 讨论

肺癌严重威胁人类健康，其死亡率占癌症相关死亡的20%^[12]，显著高于其他癌症。CSC及其他引发癌症的细胞被认为是癌细胞的一个亚群，可赋予癌细胞侵略性和耐药性，其中CSC具有自我更新、引发肿瘤和经历多种分化的能力。因此，CSC的特性已经成为肺癌治疗的靶标。

Hedgehog信号在胚胎发生和发育过程中被激活，并在许多实体瘤中被重新激活^[13-15]。Hedgehog信号涉及的蛋白质根据物种分为Sonic Hedgehog（Shh），Indian Hedgehog（Ihh）和Desert Hedgehog（Dhh）。Hedgehog信号通路由三种蛋白组成，即GPCR样蛋白Smoothed（SMO），经典受体Patched（PTCH1）和GLI1/2/3蛋白。Hedgehog信号对于自我更新、细胞命运决定和CSC形成至关重要。此外，Hedgehog信号通路还涉及肺癌的化学耐药性、复发和转移^[16]。SOX2蛋白参与多种癌症，包括黑色素瘤及乳腺癌等^[17-18]，并在结肠直肠癌中维持CSCs^[19]。有研究^[20]表明，Hedgehog-GLI信号转导与癌症的生长、致瘤性和干性有关，通过Hedgehog-GLI信号转导，GLI调节SOX2基因，而GLI介导的SOX2调节诱导黑色素瘤和肺癌CSC的自我更新。

本研究通过使用siRNA靶向敲低SMO，发现TMS可减少GLI1和GLI2的转录，并在肺癌CSC形成中发挥重要作用，表明TMS可能通过调节Hedgehog信号来抑制肺癌CSC。在裸鼠模型和细胞实验中，TMS的抗增殖浓度分别为10和5 mg/kg，所使用的TMS浓度非常高且可能诱导细胞毒性，很难将TMS用作抗癌药。为了克服这个问题，TMS的临床应用具有两种选择：一种是开发具有强抗癌活性的TMS类似物，另一种是在接受化疗的癌症患者中共同使用TMS药物。

CSC可导致肿瘤耐药、复发和转移，这是癌症死亡的主要原因^[21]。Hedgehog信号异常在多种癌症中诱导肿瘤发生和进展，包括CSC维持。SOX2调节人类黑色素瘤起始细胞的自我更新。本研究表明TMS降低了Hedgehog信号转导和SOX2表达，通过Hedgehog介导的Hedgehog信号/SOX2途径调节肺癌CSC的形成。研究结果揭示了一种新的机制，涉及由TMS在肺癌CSC中诱导的Hedgehog信号和SOX2蛋白表达，也为靶向Hedgehog信号阻止CSC的形成提供了可能，提示TMS在抗肿瘤治疗和炎性反应中的应用潜力。

综上所述，本研究发现TMS可抑制肺癌细胞的增殖和CSCs的生长，其通过降低GLI1、GLI2和SMO的蛋白表达水平，降低SOX2的转录和蛋白表达水平，调控Hedgehog信号转导以及SOX2途径调节了肺癌CSC的形成，为靶向Hedgehog信号通路和SOX2抑制肺癌CSC的形成治疗肺癌提供可能。

作者贡献

曹松：实验设计、实施及文章撰写

严晓燕、马军：实验实施

景文江、张淑莲：图表分析及文章修改

王娟毅、李翔：实验设计及指导

吴翔：实验评估及指导