肿瘤防治研究  2020, Vol. 47 Issue (6): 441-445
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引用本文 |
乳腺癌是全球女性最常见恶性肿瘤，其死亡率位居女性恶性肿瘤首位[1]。我国2014年统计乳腺癌新发病例27.89万例，占女性恶性肿瘤发病的16.51%[2]。人表皮生长因子受体HER2阳性乳腺癌约占乳腺癌的15%~20%，临床数据表明HER2阳性乳腺癌多数为浸润性导管癌，组织学分级Ⅱ~Ⅲ级，淋巴结转移发生率高、复发转移率高等特点[3-4]。目前单药靶向治疗HER2阳性乳腺癌仍有50%患者天然性耐药，联合治疗疗效提高有限且费用昂贵[5]。因而有关HER2阳性乳腺癌诊疗的靶点有待进一步研究。A激酶锚定蛋白12（A kinase anchoring protein 12, AKAP12）是一种激酶支架蛋白，参与调控细胞增殖、组织侵袭及转移[6]。文献报道其在多种类型肿瘤中均有表达下调，如肝癌[7]、直肠癌[8]、前列腺癌[9]等。本研究通过免疫组织化学检测AKAP12在HER2阳性乳腺癌中的表达，探讨AKAP12表达与HER2阳性乳腺癌临床病理因素及临床预后关系。
1 资料与方法 1.1 UALCAN分析UALCAN数据库（ualcan.path.uab.edu/）是一个TCGA在线分析网站，主要用于分析乳腺癌组织和正常组织中AKAP12基因表达水平。
1.2 临床资料选取2013年1月—2018年12月期间手术经病理确诊的120例HER2阳性乳腺癌组织、距肿瘤 > 5 cm的正常乳腺组织及8例乳腺癌转移灶组织。所有患者术前未接受放疗、化疗及内分泌治疗且病历资料完整。120例HER2阳性乳腺癌患者年龄26~87岁，平均年龄57±11.1岁。其中≤51岁有31例（25.8%），> 51岁有89例（74.2%）；未绝经32例（26.7%），已绝经88例（73.3%）；肿瘤直径≤2 cm 49例（40.8%），肿瘤直径 > 2 cm 71例（59.2%）；有腋窝淋巴结转移55例（45.8%），无淋巴结转移65例（54.2%）；AJCC（第八版）TNM分期为Ⅰ期33例（27.5%），Ⅱ+Ⅲ期87例（72.5%）；组织学分级为Ⅰ+Ⅱ级44例（36.7%），Ⅲ级76例（63.3%）；伴脉管浸润24例（20.0%），未见脉管浸润96例（80.0%）；术后辅助化疗治疗94例（78.3%），未行化疗治疗26例（21.7%）；行术后辅助放射治疗15例（12.5%），未行放射治疗105例（87.5%）。所有患者术前签署手术知情同意书，切除标本由本院保存，并可能用于科学研究。
1.3 主要试剂来源兔抗人AKAP12多克隆抗体购自Abcam公司，工作浓度为1:50。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自上海生工生物科技有限公司，工作浓度为1:200、柠檬酸-EDTA抗原修复液（40×）、PBS缓冲液、DAB显色试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.4 免疫组织化学采用免疫组织化学SP法，所有组织标本常规用10%甲醛固定、石蜡包埋，制成3 μm组织切片。选定一抗工作浓度为1:50，二甲苯脱蜡两次，水化（依次经过100%、90%、80%、70%各5 min），改进型柠檬酸抗原修复液煮沸2 h，过氧化氢灭活过氧化氢酶处理10 min，3%BSA封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗孵育1 h，DAB显色10 min，苏木精对比染色2 min，0.5%盐酸酒精分化数秒，依次经过梯度酒精脱水（70%、80%、90%、100%各10 s）。以PBS缓冲液替代一抗作空白对照，已知阳性切片作为阳性对照。
1.5 阳性结果判定采用半定量积分法判断结果：高倍镜下随机选取3个肿瘤区域，分别计算阳性细胞百分率及染色强度，最终取平均值。阳性细胞百分率：0分：无阳性着色；1分 > 0~25%；2分 > 25%~50%；3分 > 50%~75%；4分 > 75%。染色强度：0分无阳性着色；1分浅黄色；2分深黄色；3分棕黄色。染色指数=阳性细胞百分比×着色强度，最小值0分，最大值12分。≥6分为高表达；< 6分为低表达。
1.6 Bc-GenExMiner v4.4数据库分析Bc-GenExMiner v4.4（breast cancer gene-expression miner v4.4）用于分析AKAP12 mRNA表达与HER2阳性乳腺癌预后关系，以中位数为界，> 中位数为高表达，≤中位数为低表达。
1.7 统计学方法采用SPSS23.0和GraphPad Grism7.0进行统计分析。所有资料采用χ2检验或Fisher精确检验进行统计分析。采用双尾检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 AKAP12 mRNA在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达UALCAN数据库分析结果显示：与正常组织相比，HER2阳性乳腺癌组织中AKAP12 mRNA低表达，差异有统计学意义（P=1.624E-12），见图 1。
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| 图 1 mRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达 Figure 1 Expression of AKAP12 mRNA in breast cancer and para-carcinoma tissues |
AKAP12主要分布于细胞质中，部分间质可见，见图 2。排除部分有组织缺失、折叠及含有 < 15%的乳腺上皮细胞，最终用于评分的癌组织和癌旁组织各有120例和84例，其中癌组织和癌旁组织AKAP12高表达比较，差异有统计学意义（χ2=4.123, P=0.042），见表 1。
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| The low (A) and high (B) expression of AKAP12 in para-carcinoma tissues; the low (C) and high (D) expression of AKAP12 in HER2-positive breast cancer tissues; the low (E) and high (F) expression of AKAP12 in metastases tissues; G: blank control; H: positive control (×200). 图 2 AKAP12在HER2阳性乳腺癌癌组织和癌旁组织中的表达(SP ×200) Figure 2 AKAP12 expression in HER2-positive breast cancer and para-cancerous tissues (SP ×200) |
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HER2阳性乳腺癌转移灶中，AKAP12高表达与其相对应癌组织比较，差异有统计学意义（P=0.041），见表 2。
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HER2阳性乳腺癌中，AKAP12表达与患者年龄、月经状况、组织学分级、脉管浸润、有无腋窝淋巴结转移、术后辅助放化疗与否均无相关性（均P > 0.05），而与肿瘤大小和TNM分期相关，肿瘤体积越大阳性率越低；TNM分期高者，其阳性率越低（均P < 0.05），见表 3。
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采用Bc-GenExMiner v4.4数据库绘制生存曲线发现，在HER2阳性乳腺癌中，AKAP12 mRNA低表达患者总生存率显著低于高表达者（P=0.0288），见图 3。
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| 图 3 AKAP12 mRNA表达与HER2阳性乳腺癌患者预后的关系 Figure 3 Correlation of AKAP12 mRNA expression with survival of HER2-positive breast cancer patients |
在HER2阳性乳腺癌中，AKAP12低表达患者生存率低于高表达者（P=0.020），见图 4。
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| 图 4 AKAP12表达与HER2阳性乳腺癌患者预后的关系 Figure 4 Correlation of AKAP12 expression with survival of HER2-positive breast cancer patients |
单因素分析和多因素Cox回归分析证实脉管浸润（P=0.028）、AKAP12表达（P=0.028）及放射治疗（P=0.047）是影响HER2阳性乳腺癌患者预后的独立危险因素，见表 4。
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AKAP12作为A激酶锚定蛋白家族成员之一，1992年由Gelman等在重症肌无力患者血清中发现，该家族是一类细胞骨架蛋白，参与调控细胞增殖、细胞存活及侵袭信号通路激活[6]。AKAP12基因定位于6q24-25.2，据GeneCard数据库（www.genecards.org/）数据显示正常情况下AKAP12在各类型组织中广泛表达。近年文献报道AKAP12在多种恶性肿瘤中表达下调，如肝癌、直肠癌、前列腺癌等，且其低表达与肿瘤细胞增殖快、易迁移侵袭有关，提示患者预后不良[10]。Parade等[11]研究表明AKAP12可抑制良性脑膜瘤细胞侵袭迁移，干扰SF4433细胞中AKAP12表达促进细胞周期失控、增殖、迁移和侵袭。另有研究发现胰腺癌实质细胞和间质细胞中AKAP12表达下调，其低表达促进肿瘤细胞增殖及转移形成[12]。有学者采用RT-PCR研究发现肝癌组织中AKAP12 mRNA表达下调，多因素分析证实AKAP12低表达是肝癌独立预后危险因素[7]。Xie等[9]探讨前列腺癌组织AKAP12 mRNA表达与临床参数关系，研究认为AKAP12低表达与Gleason高评分有关。Liu等[8]等采用免疫组织化学检测结直肠癌组织中AKAP12的表达水平，结直肠癌组织中AKAP12低表达与肿瘤高分期及有淋巴结转移有关，低表达HDAC3通过上调AKAP12调控PI3K/AKT信号通路和减少抗凋亡蛋白bcl-2表达，抑制结直肠癌细胞生长、迁移和促进肿瘤细胞凋亡。这一结果与皮肤鳞状细胞癌一项研究相似，该研究认为皮肤鳞状细胞癌细胞系和癌组织中AKAP12显著下调，进一步分析证实癌组织中AKAP12与肿瘤分期呈负相关[13]。以上研究均表明AKAP12是一种潜在肿瘤抑制基因，其低表达与多种类型肿瘤恶性进展及预后差有关，也有研究认为AKAP12高表达与肿瘤不良预后有关，周西汉等[14]通过RT-PCR检测胃癌组织中AKAP12表达水平，发现与癌旁组织相比，胃癌组织AKAP12高表达与肿瘤高侵袭性生物性行为及预后差有关。Bateman等[15]研究卵巢癌AKAP12高表达与紫杉醇耐药正相关，认为AKAP12可作为卵巢癌的预后预测独立风险因素。
本研究结果显示，AKAP12在乳腺癌中表达下调。进一步分析发现在HER2阳性乳腺癌中，AKAP12与肿瘤大小、TNM分期有关。AKAP12或与HER2阳性乳腺癌进展有关。Bc-GenExMiner v4.4数据库分析发现AKAP12 mRNA低表达患者总生存率显著低于高表达患者（P=0.0288）。与此同时，AKAP12蛋白低表达患者总生存率显著低于高表达者（P=0.020），单因素及多因素Cox回归风险模型分析证实AKAP12表达、脉管浸润及放射治疗是影响HER2阳性乳腺癌预后的独立危险因素。综上，AKAP12低表达可能与患者预后差有关。Zhang等[16]利用GEO数据库分析发现乳腺癌中有254个差异表达基因，其中AKAP12作为miR-183-5p的靶基因显著下调，Kaplan-Meier plotter在线数据库发现AKAP12 mRNA高表达患者总生存率显著延长。Soh等[17]采用Western blot法证实与乳腺正常上皮MCF10A相比，乳腺癌细胞系中AKAP12下降，敲除AKAP12基因发现乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移侵袭能力增加。以上研究均表明AKAP12低表达或与乳腺癌进展有关。
综上所述，HER2阳性乳腺癌中AKAP12表达与肿瘤大小及TNM分期有关，AKAP12是影响HER2阳性乳腺癌预后独立风险因素，有望成为HER2阳性乳腺癌预后预测的生物学标志物。
作者贡献
程倩：临床数据收集、整理、分析、随访及文章撰写
梁瑞鹏：数据收集及临床随访
郑佳谊、冯砅锦：临床组织样本收集
刘维薇、林清：文章构思与设计及文章修改
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表1(Table 1)
