文章信息
- AKAP12在HER2阳性乳腺癌中表达及其临床意义
- AKAP12 Expression in HER2-positive Breast Cancer and Its Clinical Significance
- 肿瘤防治研究, 2020, 47(6): 441-445
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2020, 47(6): 441-445
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2020.20.0040
- 收稿日期: 2020-01-15
- 修回日期: 2020-04-21
2. 200040 上海,同济大学附属上海第十人民医院病理科;
3. 200040 上海,同济大学附属上海第十人民医院检验科;
4. 200040 上海,同济大学附属上海第十人民医院肿瘤放射治疗科
2. Department of Pathology, Shanghai Tenth People's Hospital of Tongji University, Shanghai 200040, China;
3. Objective Clinical Laboratory, Shanghai Tenth People's Hospital of Tongji University, Shanghai 200040, China;
4. Department of Radiation Oncology, Shanghai Tenth People's Hospital, Shanghai 200040, China
乳腺癌是全球女性最常见恶性肿瘤,其死亡率位居女性恶性肿瘤首位[1]。我国2014年统计乳腺癌新发病例27.89万例,占女性恶性肿瘤发病的16.51%[2]。人表皮生长因子受体HER2阳性乳腺癌约占乳腺癌的15%~20%,临床数据表明HER2阳性乳腺癌多数为浸润性导管癌,组织学分级Ⅱ~Ⅲ级,淋巴结转移发生率高、复发转移率高等特点[3-4]。目前单药靶向治疗HER2阳性乳腺癌仍有50%患者天然性耐药,联合治疗疗效提高有限且费用昂贵[5]。因而有关HER2阳性乳腺癌诊疗的靶点有待进一步研究。A激酶锚定蛋白12(A kinase anchoring protein 12, AKAP12)是一种激酶支架蛋白,参与调控细胞增殖、组织侵袭及转移[6]。文献报道其在多种类型肿瘤中均有表达下调,如肝癌[7]、直肠癌[8]、前列腺癌[9]等。本研究通过免疫组织化学检测AKAP12在HER2阳性乳腺癌中的表达,探讨AKAP12表达与HER2阳性乳腺癌临床病理因素及临床预后关系。
1 资料与方法 1.1 UALCAN分析UALCAN数据库(ualcan.path.uab.edu/)是一个TCGA在线分析网站,主要用于分析乳腺癌组织和正常组织中AKAP12基因表达水平。
1.2 临床资料选取2013年1月—2018年12月期间手术经病理确诊的120例HER2阳性乳腺癌组织、距肿瘤 > 5 cm的正常乳腺组织及8例乳腺癌转移灶组织。所有患者术前未接受放疗、化疗及内分泌治疗且病历资料完整。120例HER2阳性乳腺癌患者年龄26~87岁,平均年龄57±11.1岁。其中≤51岁有31例(25.8%),> 51岁有89例(74.2%);未绝经32例(26.7%),已绝经88例(73.3%);肿瘤直径≤2 cm 49例(40.8%),肿瘤直径 > 2 cm 71例(59.2%);有腋窝淋巴结转移55例(45.8%),无淋巴结转移65例(54.2%);AJCC(第八版)TNM分期为Ⅰ期33例(27.5%),Ⅱ+Ⅲ期87例(72.5%);组织学分级为Ⅰ+Ⅱ级44例(36.7%),Ⅲ级76例(63.3%);伴脉管浸润24例(20.0%),未见脉管浸润96例(80.0%);术后辅助化疗治疗94例(78.3%),未行化疗治疗26例(21.7%);行术后辅助放射治疗15例(12.5%),未行放射治疗105例(87.5%)。所有患者术前签署手术知情同意书,切除标本由本院保存,并可能用于科学研究。
1.3 主要试剂来源兔抗人AKAP12多克隆抗体购自Abcam公司,工作浓度为1:50。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自上海生工生物科技有限公司,工作浓度为1:200、柠檬酸-EDTA抗原修复液(40×)、PBS缓冲液、DAB显色试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.4 免疫组织化学采用免疫组织化学SP法,所有组织标本常规用10%甲醛固定、石蜡包埋,制成3 μm组织切片。选定一抗工作浓度为1:50,二甲苯脱蜡两次,水化(依次经过100%、90%、80%、70%各5 min),改进型柠檬酸抗原修复液煮沸2 h,过氧化氢灭活过氧化氢酶处理10 min,3%BSA封闭1 h,一抗4℃孵育过夜,二抗孵育1 h,DAB显色10 min,苏木精对比染色2 min,0.5%盐酸酒精分化数秒,依次经过梯度酒精脱水(70%、80%、90%、100%各10 s)。以PBS缓冲液替代一抗作空白对照,已知阳性切片作为阳性对照。
1.5 阳性结果判定采用半定量积分法判断结果:高倍镜下随机选取3个肿瘤区域,分别计算阳性细胞百分率及染色强度,最终取平均值。阳性细胞百分率:0分:无阳性着色;1分 > 0~25%;2分 > 25%~50%;3分 > 50%~75%;4分 > 75%。染色强度:0分无阳性着色;1分浅黄色;2分深黄色;3分棕黄色。染色指数=阳性细胞百分比×着色强度,最小值0分,最大值12分。≥6分为高表达;< 6分为低表达。
1.6 Bc-GenExMiner v4.4数据库分析Bc-GenExMiner v4.4(breast cancer gene-expression miner v4.4)用于分析AKAP12 mRNA表达与HER2阳性乳腺癌预后关系,以中位数为界,> 中位数为高表达,≤中位数为低表达。
1.7 统计学方法采用SPSS23.0和GraphPad Grism7.0进行统计分析。所有资料采用χ2检验或Fisher精确检验进行统计分析。采用双尾检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 AKAP12 mRNA在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达UALCAN数据库分析结果显示:与正常组织相比,HER2阳性乳腺癌组织中AKAP12 mRNA低表达,差异有统计学意义(P=1.624E-12),见图 1。
2.2 AKAP12在HER2阳性乳腺癌组织及癌旁组织中的表达AKAP12主要分布于细胞质中,部分间质可见,见图 2。排除部分有组织缺失、折叠及含有 < 15%的乳腺上皮细胞,最终用于评分的癌组织和癌旁组织各有120例和84例,其中癌组织和癌旁组织AKAP12高表达比较,差异有统计学意义(χ2=4.123, P=0.042),见表 1。
2.3 AKAP12在HER2阳性乳腺癌转移灶组织中的表达
HER2阳性乳腺癌转移灶中,AKAP12高表达与其相对应癌组织比较,差异有统计学意义(P=0.041),见表 2。
2.4 AKAP12表达与HER2阳性乳腺癌患者临床病理因素关系HER2阳性乳腺癌中,AKAP12表达与患者年龄、月经状况、组织学分级、脉管浸润、有无腋窝淋巴结转移、术后辅助放化疗与否均无相关性(均P > 0.05),而与肿瘤大小和TNM分期相关,肿瘤体积越大阳性率越低;TNM分期高者,其阳性率越低(均P < 0.05),见表 3。
2.5 AKAP12 mRNA表达与HER2阳性乳腺癌患者预后的关系采用Bc-GenExMiner v4.4数据库绘制生存曲线发现,在HER2阳性乳腺癌中,AKAP12 mRNA低表达患者总生存率显著低于高表达者(P=0.0288),见图 3。
2.6 AKAP12表达与HER2阳性乳腺癌患者预后的关系在HER2阳性乳腺癌中,AKAP12低表达患者生存率低于高表达者(P=0.020),见图 4。
2.7 影响HER2阳性乳腺癌患者预后因素单因素分析和多因素Cox回归分析证实脉管浸润(P=0.028)、AKAP12表达(P=0.028)及放射治疗(P=0.047)是影响HER2阳性乳腺癌患者预后的独立危险因素,见表 4。
3 讨论AKAP12作为A激酶锚定蛋白家族成员之一,1992年由Gelman等在重症肌无力患者血清中发现,该家族是一类细胞骨架蛋白,参与调控细胞增殖、细胞存活及侵袭信号通路激活[6]。AKAP12基因定位于6q24-25.2,据GeneCard数据库(www.genecards.org/)数据显示正常情况下AKAP12在各类型组织中广泛表达。近年文献报道AKAP12在多种恶性肿瘤中表达下调,如肝癌、直肠癌、前列腺癌等,且其低表达与肿瘤细胞增殖快、易迁移侵袭有关,提示患者预后不良[10]。Parade等[11]研究表明AKAP12可抑制良性脑膜瘤细胞侵袭迁移,干扰SF4433细胞中AKAP12表达促进细胞周期失控、增殖、迁移和侵袭。另有研究发现胰腺癌实质细胞和间质细胞中AKAP12表达下调,其低表达促进肿瘤细胞增殖及转移形成[12]。有学者采用RT-PCR研究发现肝癌组织中AKAP12 mRNA表达下调,多因素分析证实AKAP12低表达是肝癌独立预后危险因素[7]。Xie等[9]探讨前列腺癌组织AKAP12 mRNA表达与临床参数关系,研究认为AKAP12低表达与Gleason高评分有关。Liu等[8]等采用免疫组织化学检测结直肠癌组织中AKAP12的表达水平,结直肠癌组织中AKAP12低表达与肿瘤高分期及有淋巴结转移有关,低表达HDAC3通过上调AKAP12调控PI3K/AKT信号通路和减少抗凋亡蛋白bcl-2表达,抑制结直肠癌细胞生长、迁移和促进肿瘤细胞凋亡。这一结果与皮肤鳞状细胞癌一项研究相似,该研究认为皮肤鳞状细胞癌细胞系和癌组织中AKAP12显著下调,进一步分析证实癌组织中AKAP12与肿瘤分期呈负相关[13]。以上研究均表明AKAP12是一种潜在肿瘤抑制基因,其低表达与多种类型肿瘤恶性进展及预后差有关,也有研究认为AKAP12高表达与肿瘤不良预后有关,周西汉等[14]通过RT-PCR检测胃癌组织中AKAP12表达水平,发现与癌旁组织相比,胃癌组织AKAP12高表达与肿瘤高侵袭性生物性行为及预后差有关。Bateman等[15]研究卵巢癌AKAP12高表达与紫杉醇耐药正相关,认为AKAP12可作为卵巢癌的预后预测独立风险因素。
本研究结果显示,AKAP12在乳腺癌中表达下调。进一步分析发现在HER2阳性乳腺癌中,AKAP12与肿瘤大小、TNM分期有关。AKAP12或与HER2阳性乳腺癌进展有关。Bc-GenExMiner v4.4数据库分析发现AKAP12 mRNA低表达患者总生存率显著低于高表达患者(P=0.0288)。与此同时,AKAP12蛋白低表达患者总生存率显著低于高表达者(P=0.020),单因素及多因素Cox回归风险模型分析证实AKAP12表达、脉管浸润及放射治疗是影响HER2阳性乳腺癌预后的独立危险因素。综上,AKAP12低表达可能与患者预后差有关。Zhang等[16]利用GEO数据库分析发现乳腺癌中有254个差异表达基因,其中AKAP12作为miR-183-5p的靶基因显著下调,Kaplan-Meier plotter在线数据库发现AKAP12 mRNA高表达患者总生存率显著延长。Soh等[17]采用Western blot法证实与乳腺正常上皮MCF10A相比,乳腺癌细胞系中AKAP12下降,敲除AKAP12基因发现乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移侵袭能力增加。以上研究均表明AKAP12低表达或与乳腺癌进展有关。
综上所述,HER2阳性乳腺癌中AKAP12表达与肿瘤大小及TNM分期有关,AKAP12是影响HER2阳性乳腺癌预后独立风险因素,有望成为HER2阳性乳腺癌预后预测的生物学标志物。
作者贡献
程倩:临床数据收集、整理、分析、随访及文章撰写
梁瑞鹏:数据收集及临床随访
郑佳谊、冯砅锦:临床组织样本收集
刘维薇、林清:文章构思与设计及文章修改
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