肿瘤防治研究  2020, Vol. 47 Issue (6): 441-445
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管,湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
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文章信息

AKAP12在HER2阳性乳腺癌中表达及其临床意义
AKAP12 Expression in HER2-positive Breast Cancer and Its Clinical Significance
肿瘤防治研究, 2020, 47(6): 441-445
Cancer Research on Prevention and Treatment, 2020, 47(6): 441-445
http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2020.20.0040
收稿日期: 2020-01-15
修回日期: 2020-04-21
AKAP12在HER2阳性乳腺癌中表达及其临床意义
程倩1 ,    梁瑞鹏1 ,    郑佳谊2 ,    冯砅锦2 ,    刘维薇3 ,    林清1,4     
1. 232000 淮南,安徽理工大学医学院;
2. 200040 上海,同济大学附属上海第十人民医院病理科;
3. 200040 上海,同济大学附属上海第十人民医院检验科;
4. 200040 上海,同济大学附属上海第十人民医院肿瘤放射治疗科
摘要: 目的 探讨人表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌中A激酶锚定蛋白12(AKAP12)表达及与HER2阳性乳腺癌患者临床病理特征的关系和临床意义。方法 采用UALCAN数据库分析乳腺癌组织和正常组织中AKAP12 mRNA表达情况;免疫组织化学法检测120例HER2阳性乳腺癌组织、癌旁组织及8例转移灶组织中AKAP12蛋白表达,分析癌组织中AKAP12蛋白表达与临床病理因素关系;Bc-GenExMiner v4.4用于分析AKAP12 mRNA表达与HER2阳性乳腺癌预后的关系,GraphPad Prism 7.0分析AKAP12蛋白表达与HER2阳性乳腺癌预后的关系。结果 乳腺癌组织中AKAP12显著低于癌旁组织(P < 0.05),HER2阳性乳腺癌转移灶中AKAP12蛋白显著低于原发灶(P < 0.05)。AKAP12蛋白与肿瘤大小、TNM分期负相关(P < 0.05)。生存分析发现AKAP12 mRNA和蛋白低表达患者总生存期较高表达者显著缩短(P < 0.05)。单因素及多因素Cox回归分析发现AKAP12蛋白表达、脉管浸润及放射治疗是影响HER2阳性乳腺癌预后的独立风险因素。结论 AKAP12在HER2阳性乳腺癌中的低表达与患者预后差有关。
关键词: 乳腺癌    A激酶锚定蛋白12    免疫组织化学    人表皮生长因子受体2    
AKAP12 Expression in HER2-positive Breast Cancer and Its Clinical Significance
CHENG Qian1 , LIANG Ruipeng1 , ZHENG Jiayi2 , FENG Lijin2 , LIU Weiwei3 , LIN Qing1,4     
1. Department of Medicine, Anhui University of Science and Technology, Huinan 232000, China;
2. Department of Pathology, Shanghai Tenth People's Hospital of Tongji University, Shanghai 200040, China;
3. Objective Clinical Laboratory, Shanghai Tenth People's Hospital of Tongji University, Shanghai 200040, China;
4. Department of Radiation Oncology, Shanghai Tenth People's Hospital, Shanghai 200040, China
Abstract: Objective To investigate the expression of AKAP12 in HER2-positive breast cancer and its relation with clinicopathological factors and clinical significance. Methods UALCAN database was used to explore AKAP12 mRNA expression in breast cancer and para-cancerous tissues. AKAP12 protein expression in 120 cases of breast cancer tissues, adjacent tissues and 8 cases of metastases tissues were detected by immunohistochemistry. Then we analyzed the relation between AKAP12 protein expression and clinicopathological factors. Bc-GenExMiner v4.4 database was used to explore the relation between AKAP12 mRNA expression and overall survival. The relation between AKAP12 protein expression and overall survival was analyzed by GraphPad Prism 7.0. Results AKAP12 expression in breast cancer tissues was lower than that in para-cancerous tissues (P < 0.05). AKAP12 protein expression in metastasis was lower than that in primary lesion (P < 0.05). AKAP12 was negatively related to tumor size and TNM stage (P < 0.05). Survival analysis showed that patients with low AKAP12 mRNA and protein expression had shorter overall survival than those with high AKAP12 expression (P < 0.05). Univariate and multivariate Cox regression analyses revealed that AKAP12 expression, vascular infiltration and radiotherapy were independent risk factors for the prognosis of HER2-positive breast cancer patients. Conclusion The low AKAP12 expression is related to the prognosis of HER2-positive breast cancer patients.
Key words: Breast cancer    AKAP12    Immunohistochemistry    Epidermal growth factor receptor2    
0 引言

乳腺癌是全球女性最常见恶性肿瘤,其死亡率位居女性恶性肿瘤首位[1]。我国2014年统计乳腺癌新发病例27.89万例,占女性恶性肿瘤发病的16.51%[2]。人表皮生长因子受体HER2阳性乳腺癌约占乳腺癌的15%~20%,临床数据表明HER2阳性乳腺癌多数为浸润性导管癌,组织学分级Ⅱ~Ⅲ级,淋巴结转移发生率高、复发转移率高等特点[3-4]。目前单药靶向治疗HER2阳性乳腺癌仍有50%患者天然性耐药,联合治疗疗效提高有限且费用昂贵[5]。因而有关HER2阳性乳腺癌诊疗的靶点有待进一步研究。A激酶锚定蛋白12(A kinase anchoring protein 12, AKAP12)是一种激酶支架蛋白,参与调控细胞增殖、组织侵袭及转移[6]。文献报道其在多种类型肿瘤中均有表达下调,如肝癌[7]、直肠癌[8]、前列腺癌[9]等。本研究通过免疫组织化学检测AKAP12在HER2阳性乳腺癌中的表达,探讨AKAP12表达与HER2阳性乳腺癌临床病理因素及临床预后关系。

1 资料与方法 1.1 UALCAN分析

UALCAN数据库(ualcan.path.uab.edu/)是一个TCGA在线分析网站,主要用于分析乳腺癌组织和正常组织中AKAP12基因表达水平。

1.2 临床资料

选取2013年1月—2018年12月期间手术经病理确诊的120例HER2阳性乳腺癌组织、距肿瘤 > 5 cm的正常乳腺组织及8例乳腺癌转移灶组织。所有患者术前未接受放疗、化疗及内分泌治疗且病历资料完整。120例HER2阳性乳腺癌患者年龄26~87岁,平均年龄57±11.1岁。其中≤51岁有31例(25.8%),> 51岁有89例(74.2%);未绝经32例(26.7%),已绝经88例(73.3%);肿瘤直径≤2 cm 49例(40.8%),肿瘤直径 > 2 cm 71例(59.2%);有腋窝淋巴结转移55例(45.8%),无淋巴结转移65例(54.2%);AJCC(第八版)TNM分期为Ⅰ期33例(27.5%),Ⅱ+Ⅲ期87例(72.5%);组织学分级为Ⅰ+Ⅱ级44例(36.7%),Ⅲ级76例(63.3%);伴脉管浸润24例(20.0%),未见脉管浸润96例(80.0%);术后辅助化疗治疗94例(78.3%),未行化疗治疗26例(21.7%);行术后辅助放射治疗15例(12.5%),未行放射治疗105例(87.5%)。所有患者术前签署手术知情同意书,切除标本由本院保存,并可能用于科学研究。

1.3 主要试剂来源

兔抗人AKAP12多克隆抗体购自Abcam公司,工作浓度为1:50。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自上海生工生物科技有限公司,工作浓度为1:200、柠檬酸-EDTA抗原修复液(40×)、PBS缓冲液、DAB显色试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.4 免疫组织化学

采用免疫组织化学SP法,所有组织标本常规用10%甲醛固定、石蜡包埋,制成3 μm组织切片。选定一抗工作浓度为1:50,二甲苯脱蜡两次,水化(依次经过100%、90%、80%、70%各5 min),改进型柠檬酸抗原修复液煮沸2 h,过氧化氢灭活过氧化氢酶处理10 min,3%BSA封闭1 h,一抗4℃孵育过夜,二抗孵育1 h,DAB显色10 min,苏木精对比染色2 min,0.5%盐酸酒精分化数秒,依次经过梯度酒精脱水(70%、80%、90%、100%各10 s)。以PBS缓冲液替代一抗作空白对照,已知阳性切片作为阳性对照。

1.5 阳性结果判定

采用半定量积分法判断结果:高倍镜下随机选取3个肿瘤区域,分别计算阳性细胞百分率及染色强度,最终取平均值。阳性细胞百分率:0分:无阳性着色;1分 > 0~25%;2分 > 25%~50%;3分 > 50%~75%;4分 > 75%。染色强度:0分无阳性着色;1分浅黄色;2分深黄色;3分棕黄色。染色指数=阳性细胞百分比×着色强度,最小值0分,最大值12分。≥6分为高表达;< 6分为低表达。

1.6 Bc-GenExMiner v4.4数据库分析

Bc-GenExMiner v4.4(breast cancer gene-expression miner v4.4)用于分析AKAP12 mRNA表达与HER2阳性乳腺癌预后关系,以中位数为界,> 中位数为高表达,≤中位数为低表达。

1.7 统计学方法

采用SPSS23.0和GraphPad Grism7.0进行统计分析。所有资料采用χ2检验或Fisher精确检验进行统计分析。采用双尾检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 AKAP12 mRNA在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达

UALCAN数据库分析结果显示:与正常组织相比,HER2阳性乳腺癌组织中AKAP12 mRNA低表达,差异有统计学意义(P=1.624E-12),见图 1

图 1 mRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达 Figure 1 Expression of AKAP12 mRNA in breast cancer and para-carcinoma tissues
2.2 AKAP12在HER2阳性乳腺癌组织及癌旁组织中的表达

AKAP12主要分布于细胞质中,部分间质可见,见图 2。排除部分有组织缺失、折叠及含有 < 15%的乳腺上皮细胞,最终用于评分的癌组织和癌旁组织各有120例和84例,其中癌组织和癌旁组织AKAP12高表达比较,差异有统计学意义(χ2=4.123, P=0.042),见表 1

The low (A) and high (B) expression of AKAP12 in para-carcinoma tissues; the low (C) and high (D) expression of AKAP12 in HER2-positive breast cancer tissues; the low (E) and high (F) expression of AKAP12 in metastases tissues; G: blank control; H: positive control (×200). 图 2 AKAP12在HER2阳性乳腺癌癌组织和癌旁组织中的表达(SP ×200) Figure 2 AKAP12 expression in HER2-positive breast cancer and para-cancerous tissues (SP ×200)

表 1 AKAP12在HER2阳性乳腺癌组织和癌旁组织中的表达 Table 1 AKAP12 expression in HER2-positive breast cancer and para-cancerous tissues
2.3 AKAP12在HER2阳性乳腺癌转移灶组织中的表达

HER2阳性乳腺癌转移灶中,AKAP12高表达与其相对应癌组织比较,差异有统计学意义(P=0.041),见表 2

表 2 8例HER2阳性乳腺癌组织和转移灶中AKAP12表达情况 Table 2 AKAP12 expression in 8 cases of HER2-positive breast cancer and metastases tissues
2.4 AKAP12表达与HER2阳性乳腺癌患者临床病理因素关系

HER2阳性乳腺癌中,AKAP12表达与患者年龄、月经状况、组织学分级、脉管浸润、有无腋窝淋巴结转移、术后辅助放化疗与否均无相关性(均P > 0.05),而与肿瘤大小和TNM分期相关,肿瘤体积越大阳性率越低;TNM分期高者,其阳性率越低(均P < 0.05),见表 3

表 3 AKAP12表达与HER2阳性乳腺癌患者临床病理特征的关系 Table 3 Relation between AKAP12 expression and clinicopa- thological features in HER2-positive breast cancer patients
2.5 AKAP12 mRNA表达与HER2阳性乳腺癌患者预后的关系

采用Bc-GenExMiner v4.4数据库绘制生存曲线发现,在HER2阳性乳腺癌中,AKAP12 mRNA低表达患者总生存率显著低于高表达者(P=0.0288),见图 3

图 3 AKAP12 mRNA表达与HER2阳性乳腺癌患者预后的关系 Figure 3 Correlation of AKAP12 mRNA expression with survival of HER2-positive breast cancer patients
2.6 AKAP12表达与HER2阳性乳腺癌患者预后的关系

在HER2阳性乳腺癌中,AKAP12低表达患者生存率低于高表达者(P=0.020),见图 4

图 4 AKAP12表达与HER2阳性乳腺癌患者预后的关系 Figure 4 Correlation of AKAP12 expression with survival of HER2-positive breast cancer patients
2.7 影响HER2阳性乳腺癌患者预后因素

单因素分析和多因素Cox回归分析证实脉管浸润(P=0.028)、AKAP12表达(P=0.028)及放射治疗(P=0.047)是影响HER2阳性乳腺癌患者预后的独立危险因素,见表 4

表 4 Cox比例风险回归模型分析影响HER2阳性乳腺癌患者OS的因素 Table 4 Multivariate Cox regression analysis of influence factors for OS of HER2-positive breast cancer patients
3 讨论

AKAP12作为A激酶锚定蛋白家族成员之一,1992年由Gelman等在重症肌无力患者血清中发现,该家族是一类细胞骨架蛋白,参与调控细胞增殖、细胞存活及侵袭信号通路激活[6]。AKAP12基因定位于6q24-25.2,据GeneCard数据库(www.genecards.org/)数据显示正常情况下AKAP12在各类型组织中广泛表达。近年文献报道AKAP12在多种恶性肿瘤中表达下调,如肝癌、直肠癌、前列腺癌等,且其低表达与肿瘤细胞增殖快、易迁移侵袭有关,提示患者预后不良[10]。Parade等[11]研究表明AKAP12可抑制良性脑膜瘤细胞侵袭迁移,干扰SF4433细胞中AKAP12表达促进细胞周期失控、增殖、迁移和侵袭。另有研究发现胰腺癌实质细胞和间质细胞中AKAP12表达下调,其低表达促进肿瘤细胞增殖及转移形成[12]。有学者采用RT-PCR研究发现肝癌组织中AKAP12 mRNA表达下调,多因素分析证实AKAP12低表达是肝癌独立预后危险因素[7]。Xie等[9]探讨前列腺癌组织AKAP12 mRNA表达与临床参数关系,研究认为AKAP12低表达与Gleason高评分有关。Liu等[8]等采用免疫组织化学检测结直肠癌组织中AKAP12的表达水平,结直肠癌组织中AKAP12低表达与肿瘤高分期及有淋巴结转移有关,低表达HDAC3通过上调AKAP12调控PI3K/AKT信号通路和减少抗凋亡蛋白bcl-2表达,抑制结直肠癌细胞生长、迁移和促进肿瘤细胞凋亡。这一结果与皮肤鳞状细胞癌一项研究相似,该研究认为皮肤鳞状细胞癌细胞系和癌组织中AKAP12显著下调,进一步分析证实癌组织中AKAP12与肿瘤分期呈负相关[13]。以上研究均表明AKAP12是一种潜在肿瘤抑制基因,其低表达与多种类型肿瘤恶性进展及预后差有关,也有研究认为AKAP12高表达与肿瘤不良预后有关,周西汉等[14]通过RT-PCR检测胃癌组织中AKAP12表达水平,发现与癌旁组织相比,胃癌组织AKAP12高表达与肿瘤高侵袭性生物性行为及预后差有关。Bateman等[15]研究卵巢癌AKAP12高表达与紫杉醇耐药正相关,认为AKAP12可作为卵巢癌的预后预测独立风险因素。

本研究结果显示,AKAP12在乳腺癌中表达下调。进一步分析发现在HER2阳性乳腺癌中,AKAP12与肿瘤大小、TNM分期有关。AKAP12或与HER2阳性乳腺癌进展有关。Bc-GenExMiner v4.4数据库分析发现AKAP12 mRNA低表达患者总生存率显著低于高表达患者(P=0.0288)。与此同时,AKAP12蛋白低表达患者总生存率显著低于高表达者(P=0.020),单因素及多因素Cox回归风险模型分析证实AKAP12表达、脉管浸润及放射治疗是影响HER2阳性乳腺癌预后的独立危险因素。综上,AKAP12低表达可能与患者预后差有关。Zhang等[16]利用GEO数据库分析发现乳腺癌中有254个差异表达基因,其中AKAP12作为miR-183-5p的靶基因显著下调,Kaplan-Meier plotter在线数据库发现AKAP12 mRNA高表达患者总生存率显著延长。Soh等[17]采用Western blot法证实与乳腺正常上皮MCF10A相比,乳腺癌细胞系中AKAP12下降,敲除AKAP12基因发现乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移侵袭能力增加。以上研究均表明AKAP12低表达或与乳腺癌进展有关。

综上所述,HER2阳性乳腺癌中AKAP12表达与肿瘤大小及TNM分期有关,AKAP12是影响HER2阳性乳腺癌预后独立风险因素,有望成为HER2阳性乳腺癌预后预测的生物学标志物。

作者贡献

程倩:临床数据收集、整理、分析、随访及文章撰写

梁瑞鹏:数据收集及临床随访

郑佳谊、冯砅锦:临床组织样本收集

刘维薇、林清:文章构思与设计及文章修改

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