2020, Vol. 47文章信息
- 外泌体APE1对非小细胞肺癌A549细胞顺铂敏感度的影响
- Effect of Exosomal APE1 on Sensitivity of NSCLC A549 Cells to Cisplatin
- 肿瘤防治研究, 2020, 47(7): 492-497
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2020, 47(7): 492-497
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2020.19.1609
- 收稿日期: 2019-12-30
- 修回日期: 2020-03-24
引用本文 |
肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占肺癌总数的80%~85%[2]，大部分NSCLC患者在发现时，已经进入晚期[3]。含铂方案是晚期无驱动基因突变NSCLC的主要化疗方案[4]，但是由于大部分患者对铂类化疗不敏感，这些方案的治疗效果并不理想。因此探索NSCLC铂类耐药的机制，寻找有效的靶点，降低NSCLC对顺铂的抵抗能力，在NSCLC的治疗中显得尤为重要。
研究显示，对铂类化疗药物敏感度下降的NSCLC患者，血液中脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶（apurinic aprimidinic endonuclease 1, APE1）水平升高[5]，提示外周循环中的APE1可能在铂类耐药中发挥重要作用。APE1是典型的核定位蛋白，缺乏典型分泌信号肽[6]，目前其出核机制尚未完全阐明，因此血液中出现APE1蛋白这一反常现象引起了我们的思考。外泌体是内含核酸、蛋白、脂质等生物活性物质的细胞外小囊泡[7]。近年来，有研究显示APE1可通过外泌体分泌到细胞外[8]。由此，APE1可能存在于外泌体中，并通过外泌体传递到受体细胞，影响肿瘤细胞对铂类药物的敏感度。本研究选取NSCLC细胞株A549作为研究对象，观察细胞外泌体APE1的表达变化对受体细胞顺铂敏感度的影响。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国BI公司；10%去外泌体胎牛血清购自上海VivaCell公司；细胞上清外泌体提取试剂盒购自美国Invitrogen公司（货号4478359）；抗APE1（货号ab137708）、Alix（货号ab117600）、CD9（货号ab223052），CD63（货号ab59479）、β-tubulin（货号ab6046）抗体购自英国Abcam公司，抗Calnexin（AF2425）、γ-H2AX（AF5836）抗体购自中国碧云天公司，PKH26购自美国Sigma-Aldrich公司，APE1敲低和高表达慢病毒购自上海吉凯基因科技有限公司，AT-101、E3330、inhibitor compound#3购自美国Selleckchem公司。MP-4型电泳仪及转印槽（Bio-Rad公司，美国），透射电子显微镜（JEOL公司，日本），纳米粒度颗粒跟踪分析仪（ZetaView S/N 17-310，德国），激光共聚焦显微镜（Olympus公司，日本），荧光倒置显微镜（Olympus公司，日本）。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养A549细胞购自美国ATCC公司（Manassas，VA，美国）。将细胞（1×105个/毫升）接种于细胞培养皿中，使用RPMI 1640培养基（含90%RPMI1640培养液，10%胎牛血清，1%的青-链霉素），置于37 ℃、5%饱和湿度的恒温培养箱中培养。待细胞生长至80%左右，换含10%去外泌体胎牛血清培养基，继续培养48 h后，收集细胞上清液用于提取外泌体。
1.2.2 外泌体分离和鉴定取收集好的细胞培养上清液，4 ℃，500 g离心10 min，取上清液重复一次，2 000 g离心30 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤后，用细胞上清外泌体提取试剂盒，按说明书步骤提取细胞培养上清外泌体。收集的外泌体沉淀采用RIPA裂解液重悬用于Western blot分析；无菌PBS重悬用于细胞共培养实验。外泌体样本置于-80 ℃冰箱保存备用。
1.2.3 Western blot分析取收集好的外泌体裂解液，12 000 g高速离心15 min，加入5×上样缓冲液，100 ℃变性5 min。配制SDS-Page胶，蛋白上样电泳，100 V恒压条件下转膜90 min，在5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，加入一抗稀释液（APE1 1:1 000，Alix 1:1 000，CD9 1:1 000，CD63 1:1 000，Calnexin 1:1 000，β-tubulin 1:2 000，γ-H2AX 1:1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入相应种属二抗（1:5 000），37 ℃孵育1 h，TBST洗涤，采用化学发光显影系统显影。采用Gel-Pro Analyzer软件分析各组条带灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白灰度值比值，用于评估目的蛋白表达量。
1.2.4 透射电子显微镜和纳米示踪分析（NTA）取外泌体样本5 μl滴加在载样铜网上，室温孵育5 min，孵育结束后，用吸水纸在一侧吸干多余液体；向铜网上滴加一滴2%的乙酸双氧铀，室温孵育3 min；孵育结束后，用吸水纸在一侧吸干液体，室温放置2 h晾干，透射电子显微镜观察外泌体形态。取冻存样本，25 ℃水浴解冻，冰上放置。取10 μl样本进行相应比例稀释，利用纳米粒度颗粒跟踪分析仪进行纳米示踪分析。
1.2.5 慢病毒转染按1×105个/孔接种A549细胞于6孔板中，待细胞完全贴壁后，根据公式病毒体积=（MOI×细胞数目）/病毒滴度进行病毒感染，感染12 h补液培养至24 h后换正常培养基继续培养，72 h荧光表达丰度较高，用荧光显微镜观察感染效率80%左右且细胞生长状态良好，加入含一定浓度的嘌呤霉素培养基对感染的细胞进行筛选48 h，荧光显微镜下观察鉴定，扩大培养收集细胞冻存备用。细胞转染慢病毒空白或无义序列载体作为对照组（NC）。
1.2.6 APE1抑制剂处理细胞细胞分别加入3种APE1功能抑制剂（inhibitor compound #3：APE1内切酶活性的催化抑制剂；E3330：临床试验广泛应用的APE1氧化还原活性抑制剂；AT101：醋酸棉酚的R-(-)型对映体，直接与APE1相互作用的APE1活性抑制剂）5 μmol/L，处理细胞48 h。
1.2.7 外泌体染色和观察为了观察外泌体是否能够被受体细胞所吸收，采用外泌体染色试剂PKH26对外泌体染色3 min，加入血清终止染色，200 000 g超速离心2 h，去上清液，100 μl含10%FBS的DMEM用枪头轻柔重悬。与A549细胞37 ℃下共同孵育4 h，对照组（Con）细胞加PBS代替外泌体悬液，1.4%多聚甲醛常温固定15 min，PBS洗涤后DAPI常温染色15 min，PBS洗三遍，加抗荧光淬灭剂，透明指甲油封片，激光共聚焦显微镜观察外泌体被细胞摄取情况。
1.2.8 CCK-8实验相同数量的A549细胞接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后加入100 ml细胞上清提取外泌体共培养48 h。将共培养细胞接种于96孔板中，5 000个/孔，加入不同浓度的CDDP处理48 h，每孔加入含10% CCK-8检测试剂的培养基，37 ℃孵育2 h，于波长450 nm处检测吸光度值，并计算细胞存活率，存活率（%）=试验组吸光度/对照组吸光度×100%。各组实验重复3次。
1.2.9 细胞免疫荧光按照50%的密度接种A549细胞于6孔板中，待细胞完全贴壁后加入不同处理下的外泌体共培养48 h，将正常的A549细胞及共培养后的A549细胞按照60%的密度爬片于6孔板中，加入1 μg/ml CDDP处理48 h后进行免疫荧光染色。PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗2次，37 ℃下加入0.1% Triton X100打孔1 h，PBS清洗2次，加入一抗γ-H2AX（1:400），4 ℃孵育过夜，PBS清洗2次，加入对应属性的荧光二抗，37 ℃孵育1 h，PBS清洗2次，DAPI染核，清洗后脱水封片于荧光显微镜下观察。
1.3 统计学方法运用SPSS19.0软件进行统计分析，所有数据均采用均数±标准差（
透射电子显微镜下可见典型的双层膜囊泡状结构，见图 1A，NTA显示其粒径为30~120 nm，粒径分布峰型单一，见图 1B。Western blot检测显示外泌体中表达标志性蛋白（CD63, CD9, Alix），未检测到阴性对照蛋白Calnexin（一种内质网整合蛋白），见图 1C、1D。
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| A: transmission electron micrograph of A549 exosomes; B: the particle size distribution of A549 exosomes; C, D: the expression of exosome protein markers Alix, CD63, CD9 and the negative protein Calnexin detected by Western blot. 图 1 A549外泌体的鉴定 Figure 1 Identification of A549 exosomes |
不同浓度的顺铂处理A549细胞48 h后，利用CCK-8检测得出IC50值为2.04±0.39 μg/ml，见图 2A。Western blot检测发现顺铂处理细胞后，APE1表达升高（F=28.684, P=0.000），见图 2B。用2 μg/ml顺铂处理A549细胞48 h后，提取A549细胞上清中的外泌体（EXOCDDP），Western blot检测外泌体APE1蛋白表达，A549外泌体（EXO）作为对照，结果显示EXOCDDP的APE1蛋白升高（F=3.236, P=0.048），见图 2C。采用慢病毒转染细胞，成功构建了高表达APE1的细胞——A549APE1细胞（F=3.691, P=0.001），见图 2D，提取A549APE1细胞外泌体（EXOAPE1），Western blot检测发现外泌体APE1蛋白表达升高（F=2.822, P=0.013），见图 2E。以上结果表明，高表达APE1的A549细胞能够产生高表达APE1的外泌体。
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| A: dose-response viability curve of the A549 in response to various doses of cisplatin for 48h; B: APE1 expression increased in cells after A549 cells were treated with CDDP; C: APE1 expression increased in exosomes derived from CDDP treatment cells; D: APE1 expression increased in cells after A549 were transfected with lentivirus vector(NC: cells transfected with empty vector); E: APE1 expression increased in exosomes derived from high APE1 expression cells (EXONC: exosomes derived from empty vector transfected cells). 图 2 高表达APE1的A549细胞产生高表达APE1的外泌体 Figure 2 A549 cells with high expression of APE1 produced exosomes with high expression of APE1 |
共聚焦显微镜观察显示，与染色后的外泌体共培养后，A549受体细胞内出现大量红色PKH26标记的外泌体，而对照组A549细胞内未出现红色信号，见图 3A。将外泌体与受体细胞共同培养48 h，Western blot检测受体细胞APE1表达增加（F=32.176, P=0.000），见图 3B。将带有GST标签的APE1纯化蛋白与A549细胞共同孵育48 h，Western blot检测发现，细胞内未检测到外源性的GST-APE1纯化蛋白，见图 3C。以上结果说明，APE1能够通过外泌体包装的方式进入细胞，而非游离蛋白形式。
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| A: the exosomes (red) were absorbed by A549 cells; B: APE1 expression increased after A549 cells were incubated with exosomes; C: exogenous APE1 protein was not detected in A549 cells after incubation with GST-APE1 protein; Con: cells treated with PBS. 图 3 APE1以外泌体包裹的形式进入受体细胞 Figure 3 APE1 entered receptor cells in form of exosomes |
将顺铂处理细胞后产生的外泌体（EXOCDDP）与A549细胞共培养48 h后，CCK-8检测发现受体细胞在0.5 μg/ml（F=8.971, P=0.040）、1 μg/ml（F=0.259, P=0.012）、2 μg/ml（F=2.830, P=0.021）、4 μg/ml（F=0.015, P=0.018）、6 μg/ml（F=3.199, P=0.042）顺铂中的存活率明显升高，见图 4A。将EXOAPE1与受体细胞共培养48 h，CCK-8检测发现受体细胞在1 μg/ml（F=4.359, P=0.004）、2 μg/ml（F=0.153, P=0.009）、4 μg/ml（F=0.603, P=0.028）、6 μg/ml（F=1.285, P=0.018）顺铂中的存活率也明显升高，见图 4B。以上结果表明，高表达APE1的外泌体可以降低细胞对顺铂的敏感度。
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| Cell viability for A549 cells under CDDP treatment after cells co-cultured with PBS, EXO or EXOCDDP(A) and PBS, EXO or EXOAPE1(B) for 48h; *:P < 0.05, **: P < 0.01, compared with A549+EXO group. 图 4 外泌体APE1降低受体细胞对顺铂的敏感度 Figure 4 Exosome APE1 reduced sensitivity of receptor cells to cisplatin |
A549细胞采用APE1shRNA敲低内源性的APE1后（图 5A），与EXOAPE1共培养48 h。分别加入3种APE1功能抑制剂，用CCK-8检测受体细胞在顺铂中的存活率，未加抑制剂的细胞作为对照组。结果显示，当使用inhibitor compound#3抑制剂后，细胞在0.5 μg/ml（F=0.199, P=0.000）、1 g/ml（F=1.090, P=0.000）、2 μg/ml（F=1.105, P=0.000）、4 μg/ml（F=1.968, P=0.017）顺铂中的敏感度明显恢复，见图 5B。进一步观察顺铂刺激下γ-H2AX蛋白（DNA损伤的标志蛋白）的表达情况，免疫荧光显示，EXOAPE1处理受体细胞后γ-H2AX减少，使用inhibitor compound#3抑制剂后，γ-H2AX增多，见图 5C，Western blot检测得到了相似的结果（F=7.007, P=0.027），见图 5D。
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| A: APE1 expression decreased after knock-down treatment detected by Western blot; B: cell vitality significantly decreased after incubation with EXOAPE1 and inhibitor compound #3. *: P < 0.05, ***: P < 0.001, compared with control group(Con); C, D: immunofluorescence(C) and Western blot(D) showed γ-H2AX increased after incubation with EXOAPE1 and inhibitor compound #3; Con: APE1 knock down cells without APE1 inhibitor treatment. 图 5 A549受体细胞顺铂敏感度下降与APE1的碱基切除修复功能有关 Figure 5 Decrease of sensitivity of A549 receptor cells to cisplatin was related to base excision and repair function of APE1 |
以铂类为基础的联合化疗仍然是NSCLC的主要治疗手段。但是在铂类方案化疗过程中，NSCLC患者却常常由于受到耐药的制约而导致化疗失败[9]。近年来，外泌体（一种纳米粒径级别的膜性小囊泡），由于可通过其囊泡内携带的多种生物活性物质传递耐药性，而引起广泛关注[10]。APE1具有DNA损伤修复和氧化还原双功能，在NSCLC铂类耐药中发挥关键作用[11]，然而APE1在外泌体传递耐药过程中发挥的作用及其机制尚未见报道。
我们通过对NSCLC A549细胞外泌体的检测发现，外泌体中确实存在APE1蛋白的表达，且在顺铂刺激下，外泌体APE1表达升高；进一步研究发现，APE1主要是以外泌体包装的形式被受体细胞所吸收。为了验证顺铂刺激下外泌体APE1升高的现象是否与NSCLC细胞对顺铂的敏感度相关，我们构建高表达APE1的外泌体（EXOAPE1），将其与A549细胞共培养，结果发现受体细胞对药物的敏感度明显下降。以上结果表明，外泌体中的APE1能够发挥其特有的生物学功能，降低受体细胞对顺铂的敏感度。
一些研究显示，APE1的碱基切除修复功能在化学药物导致的DNA损伤修复中发挥作用[12]，另外一些研究则表明，APE1通过对一些转录因子的氧化还原调控[13]，影响肿瘤细胞的耐药性。为此我们对外泌体APE1的功能进行了初步探索发现，分别采用3种不同的APE1功能抑制对细胞进行处理，结果显示，当采用APE1的内切酶活性抑制剂（inhibitor compound #3）后，与高表达APE1外泌体共培养的A549受体细胞对顺铂的敏感度得以恢复。顺铂主要通过损伤肿瘤细胞DNA，阻止其复制和转录，最终导致细胞死亡。结果提示，在顺铂的短期刺激下，APE1的碱基切除修复功能促进顺铂导致肺腺癌细胞的DNA损伤的修复，从而在外泌体介导的顺铂抵抗中发挥主要作用。
综上所述，NSCLC细胞释放的外泌体中含有APE1，而顺铂刺激会增加外泌体的APE1水平，外泌体APE1能够被A549受体细胞所吸收，最终导致A549细胞对顺铂的敏感度下降。其中APE1的碱基切除修复功能可能发挥关键作用。然而鉴于APE1还具有氧化还原调控、调节RNA代谢[14]等多种功能，后续还需要对包括肿瘤间质细胞在内的多种不同来源的外泌体APE1的功能进行进一步的验证。此外，APE1是生物体细胞内的关键蛋白，对细胞的生存和发展至关重要，如果将细胞内的APE1敲除，细胞几乎无法存活[15]，而靶向外泌体中的APE1或许并不会影响正常细胞的功能，因此选择外泌体APE1作为肿瘤治疗的靶点值得深入研究。
作者贡献
戴楠：实验设计和论文撰写
赵晓龙：实验数据整理和统计分析
代晓燕：细胞培养、实验实施
李梦侠：课题思路指导
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