2020, Vol. 47文章信息
- 非小细胞肺癌中ARL4C的表达及其在EGFR-TKI耐药中的作用
- Expression of ARL4C in Non-small Cell Lung Cancer and Its Role in EGFR-TKI Resistance
- 肿瘤防治研究, 2020, 47(7): 498-503
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2020, 47(7): 498-503
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2020.19.1504
- 收稿日期: 2019-12-10
- 修回日期: 2020-03-18
引用本文 |
2. 350014 福州，福建省肿瘤医院，福建医科大学附属肿瘤医院肿瘤内科;
3. 350014 福州，福建省肿瘤医院，福建医科大学附属肿瘤医院病理科;
4. 350014 福州，福建省科技厅转化医学重点实验室
2. Department of Oncology, Fujian Cancer Hospital and Fujian Medical University Cancer Hospital, Fuzhou 350014, China;
3. Department of Pathology, Fujian Cancer Hospital and Fujian Medical University Cancer Hospital, Fuzhou 350014, China;
4. Fujian Provincial Key Laboratory of Translational Cancer Medicine, Fuzhou 350014, China
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居世界首位[1]。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）已成为对TKI敏感的晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者一线治疗的首选用药[2]。EGFR-TKI获得性耐药是导致NSCLC患者靶向治疗失败的重要原因之一。人EGFR T790M点突变是获得性耐药最常见的机制，约占50%以上，但仍有部分肿瘤出现耐药的机制不明确[3]。ADP-核糖基化样因子4C（ARL4C）也称为Arl7，是ADP-核糖基化因子（ADP-ribosylation factor, Arf）的亚家族成员之一，在细胞内的囊泡运输和信号转导过程中具有重要作用[4]。越来越多的研究表明，ARL4C与人类肿瘤的发生发展密切相关，但ARL4C在肿瘤中的作用机制仍不清楚。本研究旨在探讨ARL4C在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理特征的关系以及对EGFR-TKI耐药的影响。
1 材料和方法 1.1 样本收集、细胞和主要试剂收集2016年1月—2018年6月于福建省肿瘤医院进行外科手术的63例NSCLC患者的癌组织和癌旁组织，其中男34例，女29例。所有患者术前均未接受过任何治疗，新鲜组织获取后立即放入液氮，随后转入-80 ℃冰箱保存，整个收集及保存过程均按照无酶原则操作。按照UICC/AJCC第8版肺癌TNM分期：Ⅰ期31例，Ⅱ期10例，Ⅲ期19例，Ⅳ期3例。鳞癌15例，腺癌48例。本研究经过福建省肿瘤医院伦理委员会批准（审批号：SQ2019-021-01），所有患者均在手术前签署知情同意书。
人非小细胞肺癌细胞株HCC827（EGFR 19del）为厄洛替尼（Erlotinib）敏感细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（FBS, 美国Gibco公司），Erlotinib（美国Selleck公司），RNeasy Mini Kit（德国Qiagen公司），ARL4C（英国Abcam公司），β-actin、anti-rabbit HRP-conjugated IgG antibody（美国Cell Signaling Technology公司）。RevertAidTM第一链cDNA Synthesis试剂盒、HRP的增强型化学发光底物（美国Thermo公司）。Transwell小室（美国Millipore公司），MTS细胞活力检测试剂盒（美国Promega公司）。ARL4C过表达慢病毒HBLV和HBLV-ARL4C（中国汉恒生物科技公司）。
1.2 EGFR基因检测DNA提取试剂盒购自德国Qiagen，通过石蜡包埋标本提取DNA。ARMS法扩增采用实时荧光定量PCR仪（安捷伦Mx300p）。EGFR基因检测试剂盒均购自厦门艾德生物医药有限公司。所有病例检测均有阳性质控和阴性质控，操作严格按照ARMS法试剂盒说明书进行。
1.3 细胞培养、TKI耐药细胞株建立和病毒感染将HCC827细胞培养于含10%FBS、100 u/ml青霉素和100 µg/ml链霉素的RPMI 1640培养基，放置在37 ℃、5%CO2的培养箱中，2~3 d传代一次，采用对数生长细胞。HCC827细胞暴露于初始浓度为10 nmol/L的Erlotinib溶液中，并逐渐增加药物浓度至1 600 nmol/L。经过6月的筛选后撤除Erlotinib继续培养2月，MTS检测其IC50为1 843 nmol/L（为HCC827细胞的6.37倍），标记为TKI Erlotinib耐药细胞株HCC827/ER。耐药细胞培养条件：含10%FBS、100 u/ml青霉素和100 µg/ml链霉素的RPMI l640培养基置于37 ℃、5%CO2的培养箱中，2~3 d传代1次。HBLV和HBLV-ARL4C病毒以载体购自汉恒生物科技公司；HCC827/ER细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，待24 h后换液，以上各病毒MOI值为10，与6 µg/ml聚凝胺混合感染细胞，48 h后，用2 µg/ml嘌呤霉素筛选细胞两周，获得稳定转染的ARL4C过表达细胞株HCC827/ER/ARL4C-OE及其空载对照细胞株HCC827/ER/Vector。
1.4 实验方法 1.4.1 MTS法检测细胞增殖能力及IC50将HCC8277和HCC827/ER细胞以5×103个/孔种植到96孔板中，培养24 h后，加含不同浓度Erlotinib（0、100、200、400、800、1 600 nmol/L）的含血清RPMI 1640培养液，继续培养72 h。用20 µl MTS加100 µl含血清培养液，37 ℃孵育2 h，用仅含血清的RPMI 1640培养液作为背景消减，用BIO-RAD Model 680检测490 nm的吸光度值。对加入0 nmol/L的Erlotinib对照细胞活性进行归一化检测，IC50值用SPSS17.0软件进行计算。实验重复三次。
1.4.2 实时荧光定量PCR检测mRNA检测非小细胞肺癌、癌旁组织以及HCC827各实验组细胞中ARL4C的mRNA表达水平，按照说明书用RevertAid First Strand cDNA sythesis kit将1 µg总RNA反转录为cDNA。取1 µl cDNA利用Lightcycler 480 SYBR Green I Master按照说明书进行RT-qPCR，扩增程序为：95 ℃ 15 min；40个循环，每个循环中：95 ℃ 15 s; 55 ℃ 30 s; 72 ℃ 1 s; 40 ℃ 1 min; GAPDH作为内参基因。ARL4C-F-primer: 5’-CTACCGGCTCAAGTTCAACG-3’，ARL4C-R-primer: 5’-CGAGTCCACCACGTAGATGA-3’；GAPDH-F-primer: 5’-CCAGAACATCATCCCTGCCT-3’，GAPDH-R-primer: CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’，mRNA的相对定量用2-ΔΔCt法。
1.4.3 数据分析和修正以GAPDH为内参基因对各基因表达进行标准化，同时以T27癌组织表达为准，即它的表达量设为1，量化其他样本的表达量；在调整基线循环和计算阈值后，采用2-ΔΔCt法比较ARL4C的相对表达量，仪器自动根据得出的CT值（threshold cycle）运用相对定量计算公式，ΔCtpatient=CtARL4C-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtpatient-ΔCt27，RQ值为2-ΔΔCt，计算得出代表相对表达量的RQ值，为了便于统计，把RQ值取常用对数进行分析。
1.4.4 Western blot检测蛋白表达将细胞冰上裂解，超声离心后取上清液，BCA法测定蛋白浓度，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转印至硝酸纤维素膜上。3%BSA封闭1 h后分别加入稀释好的一抗4 ℃环境过夜，1×PBS洗涤4次，加入二抗封闭120 min，1×PBS洗涤3次后ECL发光试剂盒显色，凝胶成像系统照相，分析灰度值。
1.4.5 Transwell侵袭实验把各细胞浓度调整为每毫升7×105个细胞，取100 µl接种于Transwell上室，下方用1 mg/ml的纤连蛋白进行包被，下室用含20%FBS的培养基作为趋化吸引条件，把小室悬挂在24孔板中。37 ℃孵育48 h，上室细胞用棉签擦除，小室用甲醇固定15 min晾干，用0.1%的结晶紫进行染色。随机选取5个视野进行观察，倒置显微镜（×200）下观察计数，以确定各组细胞的平均数。实验重复三次。
1.5 统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。配对资料比较采用配对t检验；两组间比较先进行正态性检验及方差齐性分析，再进行两独立样本t检验。计量资料以
非小细胞肺癌组织中ARL4C的平均相对表达量lgRQ为0.0389±0.0617，而相应癌旁组织的相对表达量lgRQ为0.2445±0.0623，两组间差异有统计学意义（P=0.0206），见图 1。
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| 图 1 ARL4C在非小细胞肺癌及癌旁组织中的表达 Figure 1 ARL4C expression in NSCLC and paracancerous tissues |
结果表明，ARL4C mRNA的表达水平与淋巴结转移、TNM分期及肺膜侵犯密切相关（P < 0.05），而与肿瘤大小、性别、年龄、肿瘤位置及组织分型无明显相关性（P > 0.05），见表 1。
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63例非小细胞肺癌中，42例进行EGFR基因突变检测，其中EGFR基因突变组22例，EGFR野生型组20例。EGFR基因突变组，除常规突变外还包括1例T790M突变。EGFR基因突变组ARL4C mRNA的表达水平为-0.064±0.091，而EGFR野生型组表达水平为-0.0634±0.091，两组间差异无统计学意义（P=0.476）。结果表明，ARL4C mRNA表达水平与EGFR的突变状态无显著相关性。
2.4 ARL4C在EGFR-TKI耐药细胞株HCC827/ER中的表达HCC827/ER细胞株中ARL4CmRNA和蛋白的表达水平分别为HCC827细胞株的0.084和0.095倍，差异有统计学意义（P < 0.0001），见图 2。
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| 图 2 EGFR-TKI耐药细胞株(HCC827/ER)中ARL4C mRNA(A)及蛋白(B)的表达 Figure 2 ARL4C mRNA(A) and protein(B) expression in EGFR-TKI-resistant cell line HCC827/ER |
RT-qPCR和Western blot结果显示，ARL4C在HCC827/ER/ARL4C-OE中mRNA和蛋白分别是HCC827/ER/Vector的58.28和11.89倍，差异有统计学意义（P < 0.001），见图 3。
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| 图 3 ARL4C mRNA(A)和蛋白(B)在HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE细胞株中的表达 Figure 3 ARL4C mRNA(A) and protein(B) expression in HCC827/ER/Vector and HCC827/ER/ARL4C-OE cell lines |
MTS方法检测结果显示，HCC827/ER、HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE细胞的IC50分别为：1 849.7、1 714.4和464.1 nmol/L；HCC827/ER/ARL4C-OE在不同浓度的Erlotinib作用下，细胞活性相比于HCC827/ER/Vector显著下调，差异有统计学意义（P < 0.05），见图 4。
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| 图 4 ARL4C过表达对耐药株HCC827/ER细胞生长活性及耐药敏感度的影响 Figure 4 Effects of ARL4C overexpression on growth activity and drug resistance sensitivity of HCC827/ER cells |
结果显示，穿过聚碳酸酯多孔滤膜的HCC827/ER、HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE细胞数量分别为：531.7±10.33、489.7±6.360和282.0±3.786个。与HCC827/ER/Vector细胞相比，HCC827/ER/ARL4C-OE细胞的迁移能力明显降低（P < 0.0001），见图 5。
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| 图 5 ARL4C过表达对HCC827/ER细胞迁移能力的影响 Figure 5 Effects of ARL4C overexpression on migration of HCC827/ER cells |
EGFR-TKI靶向治疗是肺癌精准治疗的核心，能延长EGFR敏感突变非小细胞患者无进展生存期（progression free survival, PFS），改善患者生活质量[2]。EGFR-TKI获得性耐药是导致非小细胞肺癌患者治疗失败的重要原因。因此阐明EGFR-TKI的耐药机制、寻找新的药物靶点、研发新的药物成为临床中亟待解决的问题。
目前，我们对EGFR-TKI耐药分子机制的认知研究还处于探索阶段。已有的研究报道认为可能与以下机制有关：（1）EGFR基因突变诱导的耐药EGFR基因的敏感突变与耐药突变共存，如20外显子插入突变、T790M突变；（2）EGFR通路下游基因突变诱导的耐药，如EGFRl通路下游KRAS、Braf、PIK3CA等发生突变[5-6]。据文献报道，EGFR-TKI耐药的发生率为5%~20%，远高于EGFR敏感突变合并上述耐药突变的发生率，所以上述分子机制不能完全解释EGFR-TKI耐药的原因[7]。在前期工作中，通过分析文献的数据库[8]，利用生物信息手段筛查出肿瘤相关的基因ARL4C。本研究结果显示，ARL4C不仅与非小细胞肺癌临床病理特征密切相关，而且对EGFR-TKI耐药有重要调控作用。
研究显示，高表达ARL4C可以抑制卵巢癌细胞的迁移，但是对肿瘤细胞的增殖无影响，并且高表达ARL4C mRNA的卵巢癌患者具有良好的预后[4]。而关于结直肠癌和胃癌研究表明，ARL4C表达异常并参与肿瘤细胞生长和侵袭转移[9-10]，本研究结果与前者相一致。本研究显示，非小细胞肺癌组织ARL4C表达相比于癌旁组织下调（P < 0.05）。进一步临床病理分析表明，ARL4C mRNA表达与淋巴结转移、TNM分期及肺膜侵犯密切相关（P < 0.05）。结果表明，ARL4C在非小细胞肺癌中有抑癌基因作用。ARL4C在不同肿瘤中作用不同，表明肿瘤异质性的特点。
qRT-PCR和Western blot检测结果表明，与非小细胞肺癌细胞株HCC827相比，EGFR-TKI耐药的细胞株HCC827/ER中ARL4C表达显著下调。MTS细胞活性检测表明，与HCC827/ER/Vector相比，过表达ARL4C的HCC827/ER细胞株HCC827/ER/ARL4C-OE IC50由1 714.4 nmol/L下降至464.1 nmol/L。Transwell结果显示，与HCC827/ER/Vector相比，HCC827/ER/ARL4C-OE细胞的侵袭能力明显减弱（P < 0.05）。以上结果表明，过表达ARL4C能提高非小细胞肺癌细胞对EGFR-TKI药物的敏感度并抑制肺癌细胞的侵袭能力。
EGFR 20号外显子T790M位的突变是产生TKI获得性耐药的重要原因之一[11-12]。EGFR基因突变状态与ARL4C表达相关性分析显示，ARL4C mRNA表达水平与EGFR的突变状态无显著相关性。本研究中有1例EGFR T790M突变，其ARL4C表达水平为-0.148，低于非小细胞肺癌平均表达水平（0.0389）。ARL4C表达是否与EGFR T790M突变相关需要进一步扩大病例数进行研究。
Wnt/β-catenin信号转导通路在肺癌发生发展中起着重要作用[13]，它和EGFR信号通路在肿瘤发生发展中存在交叉作用。相关研究显示，在非小细胞肺癌中，EGFR基因突变伴随着Wnt通路负调控因子的甲基化及β-catenin的过表达[14]。另有研究表明，ARL4C是Wnt/β-catenin和生长因子Ras信号转导的下游靶标，并且Wnt/β-catenin/Ras/ARL4C信号轴在发育性小管生成和肿瘤发生中均起着重要作用[4]。我们猜测，Wnt/β-catenin/Ras/ARL4C信号轴可能参与非小细胞肺癌EGFR-TKI的耐药。
综上所述，ARL4C在非小细胞肺癌的发生发展过程中发挥重要作用，并且与淋巴结转移、TNM分期和肺膜侵犯密切相关。过表达ARL4C能提高非小细胞肺癌耐药细胞HCC827/ER对EGFR-TKI药物的敏感度并抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭能力。ARL4C的表达可考虑作为判断非小细胞肺癌恶性程度及EGFR-TKI敏感度的重要标志物。
作者贡献
陈增：实验设计、实施及文章执笔
廖锦容：实验实施及文章执笔
苏颖、胡丹、林可焴：部分生物学功能研究
何志勇、金善丰、林仁章：提供病例及收集临床资料
林贤东：实验设计、评估及文章审校
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