肿瘤防治研究  2020, Vol. 47 Issue (4): 251-255
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引用本文 |
外被体包被蛋白β2亚基（coatomer protein complex subunit beta 2, COPB2）参与构成外被体包被蛋白复合体I，主要负责细胞内高尔基体和内质网间的囊泡转运[1-2]。在保持内质网、高尔基体的完整性，维持细胞稳态中发挥重要作用。随着研究的深入，人们发现COPB2除了参与囊泡运输外，COPB2还与细胞周期调控[3]、细胞凋亡[4-5]密切相关，并且还参与多条细胞信号通路转导[6-9]。近年来多项研究显示，COPB2基因在上皮来源癌细胞中呈高表达，并能够通过不同分子调控机制及信号通路影响细胞周期、凋亡，从而促进癌细胞异常增殖，并且COPB2的表达水平与患者预后相关，COPB2高表达患者预后较差[4, 8-10]。COPB2在上皮来源恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用。
COPB2在人骨肉瘤细胞中的表达水平、在人骨肉瘤的发生发展中的作用，尚无文献报道。为探讨COPB2对人骨肉瘤细胞的分子调控机制，本研究首先检测COPB2在人骨肉瘤细胞系中的表达情况，进一步基于IPA软件（ingenuity pathway analysis）的生物信息学分析，探析COPB2对人骨肉瘤细胞可能的分子调控机制，为后续进一步研究提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 RT-qPCR检测COPB2在人骨肉瘤细胞系中的表达水平人骨肉瘤细胞系U-2OS、MG-63、HOS购自上海吉凯基因化学技术有限公司，Saos-2购自中科院。以2×104/ml密度制成细胞悬液，接种于6孔板，每种细胞设3个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞生长达80%时收集细胞，应用TRIzol法进行总RNA提取，RNA反转录后行RT-qPCR检测（SYBR Master Mixture，TAKARA）。选用GADPH为内参，GAPDH：上游5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’；COPB2：上游-5’GTGGGGACAAGCCATACCTC-3’，下游5’-GTGCTCTCAAGCCGGTAGG-3’。测定ΔCt值，当ΔCt值≤12时，该细胞中基因为高丰度表达。
1.2 应用RNAi技术下调U-2OS细胞COPB2表达人骨肉瘤细胞系U-2OS，以培养基按2×104个每毫升密度制成细胞悬液，接种于6孔板中培养。细胞分为COPB2沉默组（knock down, KD）和对照组（normal control, NC），每组设3个复孔。定期更换培养基，待细胞密度达到2×104个每毫升时，更换绿色荧光蛋白慢病毒培养基继续培养（KD组慢病毒含COPB2沉默序列：LVPGCSIL-004PSC3634-2；NC组不含COPB2沉默序列：psc3741。慢病毒由上海吉凯基因技术有限公司提供），感染复数10:1。感染后16 h更换普通培养基继续培养，感染后72 h收集细胞在荧光显微镜下观察并应用RT-qPCR检测COPB2基因沉默效率。COPB2和GADPH上下游引物序列同上。应用2-∆∆Ct法进行数据分析。
1.3 人基因表达谱分析收集KD和NC组细胞，采用TRIzol法进行总RNA抽提，抽提所得总RNA经NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100质检（质控标准：NanoDrop 2000-1.7 < A260/A280 < 2.2；Agilent 2100 Bioanalyzer-RIN≥7.0，并且28S/18S > 0.7）。应用体外反转录试剂盒（GeneChip 3’IVT Express Kit，Affymetrix）制备带生物素标志的aRNA（amplified RNA）。将aRNA进行纯化，然后将其片段化后与芯片探针杂交。应用人基因表达谱芯片（GeneChip PrimeView human, Affymetrix）对两组细胞进行基因表达谱检测，基因表现有显著差异的筛选标准为：倍数变化在1.5倍以上（|倍数变化/FC| > 1.5），并且差异有统计学意义（P < 0.05）。
1.4 IPA分析将得到的基因表达谱分析结果输入在线整合分析软件—IPA软件系统（http://www.ingenuity.com/）进行分析[11]。
1.4.1 经典通路分析首先基于差异基因列表与各个通路包含的基因集合，通过计算显著性（P < 0.05）来找到表达差异基因主要富集在哪些通路中；接下来基于差异基因受调控信息（上调/下调）并与文献记载的调控信息相比较（|Z| > 2），明确调控通路。
1.4.2 疾病功能分析基于数据库（Ingenuity Knowledge Base），分析差异基因在不同疾病与功能分类中的富集情况（P < 0.05，|Z| > 2）。
1.4.3 互作网络分析对每一个调控网络进行打分，该分值检测了同一个网络中差异基因的数量，同一个网络中包含实验差异基因的数量越多，得分则越高。
1.5 统计学方法采用SPSS21.0统计软件进行方差分析，计量资料均采用均值±标准差（x±s）表示。两组数据比较前采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，Levene检验方法进行方差齐性检验，满足条件时采用独立样本t检验；不满足条件时采用Wilcoxon符号秩和检验。生物信息分析统计由IPA软件实现。P < 0.05为差异有统计学意义，|Z评分| > 2视为COPB2对差异基因的调控有意义。
2 结果 2.1 RT-qPCR检测COPB2在人骨肉瘤细胞系中的表达水平RT-qPCR结果显示COPB2在人骨肉瘤细胞系U-2OS、MG-63、HOS和Saos-2中表达丰度均较高，见图 1。ΔCt值分别为7.08±0.10、4.88±0.40、5.38±0.20和4.51±0.03。
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| RT-qPCR results showed that the COPB2 gene was highly expressed in human osteosarcoma cell lines U-2OS (ΔCt=7.08±0.10), MG-63 (ΔCt=4.88±0.40), HOS (ΔCt=5.38±0.20) and Saos-2 (ΔCt=4.51±0.03) with GAPDH as an internal reference. (ΔCt=the Ct value of the target gene－the Ct value of the internal reference gene. When the ΔCt value is≤12, the target gene is highly expressed in the cells). 图 1 RT-qPCR检测COPB2表达情况 Figure 1 COPB2 expression detected by RT-qPCR |
KD组和NC组U-2OS细胞在慢病毒感染后均贴壁成团生长，细胞形态呈不规则三角形或长梭形。荧光显微镜显示大部分细胞表达绿色荧光蛋白，提示慢病毒感染效率较高，见图 2A~2D。RT-qPCR结果显示KD组COPB2 mRNA表达水平为NC组的14.8%，差异有统计学意义（P=0.001），见图 2E。
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| NC: control group; KD: silence group; U-2OS cells of NC(A, B) and KD(C, D) group: Under the microscope, U-2OS cells adhered to a cluster to grow, showing irregular triangle or long spindle shape, most of the cells expressed green fluorescent protein (×100); E: The mRNA expression level of COPB2 gene was significantly decreased in KD group (P=0.001). 图 2 慢病毒感染沉默COPB2基因 Figure 2 COBP2 gene was silenced by lentiviral |
KD组COPB2表达水平较NC组下降4.0倍（FC=-4.0）。两组相比，1393个基因表达出现显著差异，其中上调基因数831个，下调基因数562个，见图 3。
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| A: volcano plot; red indicated all probes with fold change greater than 1.5 and P < 0.05. KD was down-regulated relative to NC on the left and up-regulated on the right. B: Scatter plot: The upper part above the upper green line indicated that the KD exhibited a 1.5-fold down-regulation of the probe relative to the NC, and the lower part below the lower green line indicated that the KD exhibited a 1.5-fold up-regulation with respect to the NC. 图 3 人基因表达谱分析结果 Figure 3 Human gene expression profiling results |
经典通路分析结果显示，在已知的400条经典通路中，150条转导通路中差异基因富集达到显著水平（P < 0.05），其中3条转导通路|Z| > 2，这三条通路及其富集的差异基因包括凝血栓蛋白1（thrombospondin 1, TSP1）抑制血管形成通路、急性期反应通路、细胞周期蛋白和细胞周期调控通路，见表 1。
疾病功能分析结果显示，被激活的功能主要集中在恶性肿瘤、机体损伤与异常、细胞运动中，与细胞瘤变、肿瘤细胞侵袭和细胞侵袭相关。被抑制的功能主要集中在细胞生存与死亡、机体损伤与异常中，与细胞失巢凋亡、机体死亡和器官退变相关，见表 2。疾病功能分析结果显示COPB2基因与骨肉瘤细胞瘤变、侵袭力和失巢凋亡等功能相关。
互作网络分析结果显示差异基因的生物功能主要集中在恶性肿瘤、细胞周期和机体损伤与异常。差异基因包括ACSL3、AFF4、Alpha tubulin、ANKRD28、ANKRD37、BAG2、Beta Tubulin、CBLB、CCT5、DISC1、DNM3、DPCD、Dynamin、FKBP5、GSE1、HMG20A、ITSN1、LZTFL1、MED12、mediator、NDRG1、p85（pik3r）、PINK1、PPP4R3B、PPP6C、RPAP3、SCOC、SMARCC1、Spectrin、SYBU、TAB 2、TCP1、TGFBR2、TNKS、TTC8，该网络得分35分。
3 讨论骨肉瘤是一种由间充质干细胞或骨母细胞染色体异位、基因突变、细胞异常分化导致的高度恶性肿瘤，最常见于儿童和青少年[12]。手术联合化疗仍是骨肉瘤治疗的标准治疗方案，但局限性骨肉瘤患者5年生存率不超过70%，且出现肺转移后仅15%~30%，治疗效果差强人意[13]。特别是对于化疗药物反应不佳的骨肉瘤患者，目前临床缺乏行之有效的治疗手段[14]。究其原因，在于骨肉瘤的分子发病机制尚不明确。因此，对骨肉瘤发病机制的深入研究和新的精准治疗靶点的寻找极为重要。
本研究基于IPA生物信息学分析，对COPB2在人骨肉瘤中的可能作用和作用机制进行探析。结果显示COPB2在人骨肉瘤细胞系中呈高表达，可能通过TSP1抑制血管形成通路、急性期反应通路、细胞周期蛋白和细胞周期调控通路在肿瘤发生发展中起到重要作用，并对骨肉瘤细胞侵袭能力、增殖凋亡发挥调控作用。
IPA经典通路分析结果显示，三条通路被显著激活或抑制。TSP1是一种糖蛋白，来源于血小板的α颗粒，通过与CD47结合在止血和血管形成过程中发挥重要作用[15]。急性期反应是机体对外界刺激所作出的应激反应，表现为体内某种特殊分子浓度的改变，激发机体的特定功能，而细胞周期调控则维持着组织器官的正常功能及损伤修复。上述三个信号通路中，细胞周期调控通路与恶性肿瘤最为相关。细胞增殖异常与恶性肿瘤发生、发展关系密切。Cheng等[16]研究显示细胞周期调控蛋白在骨肉瘤的发生发展中起到关键作用，作为骨肉瘤治疗的药物靶点，有着较好的研究前景。细胞周期调控蛋白中，以cyclinD1（CCND1）、p21（CDKN1A）、cyclinD2（CCND2）和cyclinE2（CCNE2）与骨肉瘤关系密切，cyclinD1、cyclinD2和cyclinE2是G1期的主要调控蛋白，异常表达后会导致细胞周期G1期缩短，大量细胞进入S期，细胞增殖异常，已被证实与乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤相关[17-18]。此外p21被证实在骨肉瘤肿瘤组织中的表达水平高于癌旁组织[19]。
COPB2作为外被体包被蛋白复合体Ⅰ的7个亚基之一，对细胞周期也具有一定的调控作用。COPB2能够辅助锌指X连接蛋白向细胞核内转运，促进rDNA转录，调控细胞增殖[3]。在恶性肿瘤领域，Wang等[6]以结肠癌细胞系为研究对象，应用慢病毒介导RNAi技术沉默COPB2表达，COPB2沉默组细胞增殖能力和细胞克隆能力下降，进一步发现COPB2沉默后p16和p21表达水平升高，从而cyclinA1和cyclinA2表达水平降低。研究结果提示COPB2基因能够通过调节cyclinA1、cyclinA2，对细胞周期发挥调控作用。因此，COPB2表达异常能够对细胞周期调控产生影响，促进恶性肿瘤的发生发展。
综上所述，COPB2在人骨肉瘤细胞系U-2OS、MG-63、HOS和Saos-2中高表达，可能通过细胞周期蛋白和细胞周期调控通路参与骨肉瘤的发生发展。此外，COPB2与骨肉瘤细胞瘤变、侵袭力和失巢凋亡相关。
作者贡献
崔云鹏、潘元星：实验实施、数据分析及论文撰写
林云飞：数据收集
米川、王冰：实验指导
施学东：研究设计及文章修改
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表1(Table 1)
