0 引言

骨肉瘤常见于儿童和青少年长骨的干骺端^[1]，国内发病率约为3/100万，占恶性肿瘤的0.2%，是青少年骨肿瘤中主要的死亡因素^[2]。治疗上虽然已经取得很大进展，但患者的预后及生活质量仍令人失望^[3]。

近年来，骨肉瘤基因组学和蛋白组学研究得到了快速发展^[4]，但临床获益十分有限，进而转向肿瘤微环境研究^[5-6]。据报道微环境通过多种途径促进肿瘤进展^[7-9]。如巨噬细胞作为微环境中最丰富的白细胞，被认为与各种人类恶性肿瘤的血管生成、远处转移^[10]以及化疗耐药^[11]有关。M1型巨噬细胞高表达IL-12、IL-23和CD68，具有抗肿瘤作用。M2型巨噬细胞分泌高水平的IL-10、CD163和CD204，通常具有促瘤作用。

有研究证明骨肉瘤微环境中存在M2型巨噬细胞^{[10, 12]}，但尚未系统地探讨M2型巨噬细胞的转化。有学者提出酸性微环境在M2型巨噬细胞转化中至关重要，缺氧产生的酸性微环境可能引发巨噬细胞中的HIF-1α活化及精氨酸酶-1和IL-10的过表达^[13]。

研究发现M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2, PKM2）升高导致骨肉瘤预后不良^[14]。由于PKM2能促进乳酸分泌，而乳酸对酸性微环境具有广泛的促进作用，本实验研究了M2型巨噬细胞浸润及PKM2在骨肉瘤中表达的预后意义。

1 资料与方法 1.1 临床资料

收集2010—2014年南华大学附属第二医院病理科88例原发性骨肉瘤石蜡包埋标本。回顾性分析年龄、性别、发病部位、肿瘤大小、组织学分级、ALP、LDH、远处转移、局部疼痛和Eneeking分期等临床参数。根据Eneeking分期系统对肿瘤进行分期，并根据世界卫生组织（WHO）分类标准进行组织学分级。获得患者书面知情同意及南华大学附属第二医院伦理委员会的批准。

1.2 材料

组织微阵列的构建由上海生物芯片公司制作；PKM2兔多克隆抗体为美国CST公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）及Gene Tech GTVision Ⅲ检测试剂盒为中国上海基因科技公司产品；Human CD163试剂盒为美国R & D公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 组织芯片及标本处理

对患者的石蜡包埋标本进行组织微阵列构建，该微阵列的构建是与上海生物芯片合作建造。来自原发肿瘤的苏木精和伊红（HE）染色切片用于定义代表性肿瘤区域和邻近的正常组织；代表性肿瘤区域定义为包含超过75%癌细胞而没有坏死的肿瘤区域，随机选择与肿瘤区域相距至少5.0 cm的相邻正常组织作为对照。使用组织微阵列仪（USA）从组织块的限定区域冲压圆柱体（直径1.5 mm）并插入受体石蜡块中，将这些切片转移到载玻片上。

1.3.2 免疫组织化学染色

将组织微阵列载玻片用二甲苯脱石蜡，然后用乙醇浸泡水化。在含有0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）的压力锅中进行热介导的抗原修复，修复液没过切片组织，再将上述容器放入加有适量自来水的高压锅内，加盖加热2 min后熄火并冷却至室温。磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，3%过氧化氢孵育5 min阻断多余的过氧化物酶活性。滴加兔抗人多克隆抗体PKM2抗体（1:100）于切片上置湿盒4℃下培养过夜，样品与辣根过氧化物酶在室温下孵育40 min。在PBS中洗涤3~5 min后，用3, 3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液检测PKM2。

1.3.3 镜下观察及评估

M2巨噬细胞定义为卵圆形或圆形细胞核，具有膜或细胞质CD163染色。低倍（×100）下扫描染色的切片以确定巨噬细胞浸润最丰富的区域。高倍镜（×400）下对5个区域的巨噬细胞进行计数。根据细胞计数将浸润巨噬细胞密度分为4类:（0）缺失（< 20/mm²）；（1）弱浸润（20~40/mm²）；（2）中度浸润（40~60/mm²）；（3）高度浸润（60/mm²）。在统计分析中，分为阴性（0~1）或阳性（2~3）浸润。由对临床信息不知情的两名病理科医师进行评估。

1.4 统计学方法

使用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。Pearson χ²检验研究临床病理学参数和CD163表达之间的关系，采用Spearman秩检验评价PKM2与CD163的相关性，Kaplan-Meier分析预后价值，Cox回归模型进行参数与患者预后的相关性分析。多因素分析进一步检验单因素分析中与总体生存率相关的因素。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 M2巨噬细胞在骨肉瘤组织中高度浸润

为了证实M2巨噬细胞在骨肉瘤中的生物学意义，首先检测了CD163的表达来观察其是否存在于骨肉瘤中，CD163染色范围从阴性到阳性，见图 1A、1B。70.5%的患者M2巨噬细胞浸润阳性，提示M2巨噬细胞在骨肉瘤中高度浸润。此外，骨肉瘤组织中M2巨噬细胞的浸润较癌旁组织更为丰富（P < 0.05），见表 1、图 1C。

2.2 CD163细胞与临床病理特征的相关性

基质中M2巨噬细胞与Eneeking分期呈正相关（P=0.003），与年龄、性别、肿瘤部位等参数无关，见表 2。

2.3 M2巨噬细胞浸润情况

M2巨噬细胞浸润阳性的患者存活率明显低于阴性患者（P=0.009），见图 1C。基质中M2巨噬细胞浸润的升高是患者的独立不良预后因素（P=0.010, HR=2.02, 95%CI: 1.16~3.49），见表 3。

2.4 PKM2过表达与间质M2巨噬细胞浸润

在显微镜下观察PKM2和CD163的连续切片染色情况，发现PKM2表达升高的患者伴有高M2巨噬细胞浸润，见图 2A。Spearman测定表明癌细胞的PKM2表达与骨肉瘤中的M2巨噬细胞浸润正相关（P < 0.001, r=0.390），见图 2B。进一步研究PKM2和CD163在骨肉瘤中的组合模式，发现它们的过表达都给患者带来了极不良的预后（P < 0.05），见图 2C~D。Cox回归分析表明骨肉瘤中PKM2表达升高，巨噬细胞CD163表达是骨肉瘤的独立不良预后因子（P=0.001, HR=2.71, 95%CI: 1.53~4.80），见表 3。

3 讨论

近期，越来越多研究开始探索有氧糖酵解在恶性肿瘤中的作用，前者与后者的发生及发展密切相关。有研究表明，肿瘤细胞需要多种生物分子才能增殖与迁移，而肿瘤细胞中更高水平的有氧糖酵解途径可以为其提供这些物质^[15-16]。作为参与有氧糖酵解的关键酶，PKM2在恶性肿瘤患者中表达明显升高，骨肉瘤亦不例外，且PKM2高表达与肿瘤中的不利表型相关^[17-19]。Morfouace等^[20]的一项研究表明，PKM2升高可通过上调Oct4的表达，从而抑制胶质瘤干细胞进而降低胶质瘤发生。此外，还有报道称PKM2表达升高可通过增强上皮-间质转化促进肿瘤进展^[21]。但关于PKM2促进骨肉瘤进展的机制尚需进一步探讨，本研究发现PKM2与M2巨噬细胞呈正相关，这表明PKM2可能通过促进免疫抑制表型巨噬细胞浸润作用从而促进骨肉瘤进展。

M2巨噬细胞可能与肿瘤形成密切相关^{[10, 17]}。本研究发现M2巨噬细胞高度浸润组生存结果较差，CD163不只是M2巨噬细胞的特异性表面标志物，因此尚需研究M2巨噬细胞的其他标志物以进一步完善该实验结果。

M2巨噬细胞亦被认为有促进骨肉瘤进展的作用，因此抑制M2巨噬细胞可能具有很大的临床意义。总之，针对恶性肿瘤中M2巨噬细胞的潜在治疗策略包括抑制单核细胞聚集，抑制单核细胞极化和消除完全成熟的M2巨噬细胞^[11]。本研究结果提示，针对PKM2或联合M2巨噬细胞的靶向治疗可能为骨肉瘤的替代治疗方法。

本研究探讨了M2巨噬细胞的生物学意义及其在骨肉瘤中转化的潜在机制，发现M2巨噬细胞在骨肉瘤中高度浸润，可能为患者预后不良的相关因素，同时发现，在骨肉瘤中PKM2表达与M2巨噬细胞浸润呈正相关，其中M2细胞高度浸润及PKM2高表达组预后最差。基于本研究结果，推测PKM2升高可促进乳酸分泌，从而激活巨噬细胞的p38/MAPK信号通路，导致M2巨噬细胞极化，最终促进骨肉瘤的进展。

上述数据提示PKM2和CD163在骨肉瘤中存在交叉表达。对文献的全面综述表明M2巨噬细胞极化部分独立于酸性微环境，考虑到乳酸是酸性条件的重要贡献者，并且PKM2是乳酸生成的关键酶，因此我们拟提出将骨肉瘤中的PKM2和M2巨噬细胞联系起来的模型，见图 3，其包括PKM2表达升高和癌细胞的乳酸表达，p38/MAPK巨噬细胞的激活以及M2极化。

作者贡献

谭文甫：文章撰写

杨俊涛：构思设计

夏雪：数据分析

向仁堃：数据获取

王晓旭：文章修改