0 引言

食管癌是一种高发病率和高死亡率的疾病^[1-2]，主要由食管黏膜上皮细胞异型增生而来，分为食管鳞癌和食管腺癌两种。发展中国家和亚洲地区食管癌病理类型主要是食管鳞癌，我国约86%以上的患者都属此列^[3]。临床上晚期食管鳞癌5年总体生存率低于15%，早期食管鳞癌患者存活率则可以超过80%^[4-6]。手术对早期食管鳞癌疗效确切，术后放化疗疗效仍有争议，靶向治疗已被证实对多种恶性肿瘤效果良好，但目前食管鳞癌的靶向治疗仍缺乏更加有效的治疗靶点。

环状RNA是一种非编码RNA，HIPK3可以产生22种环状RNA，其中3种存在于动物体内，其余19种存在于人体细胞。有研究发现CircHIPK3在多个恶性肿瘤内存在表达异常^[7-9]。本文研究了食管鳞癌组织中CircHIPK3表达异常对食管鳞癌的影响，以期为食管鳞癌的诊断和靶向治疗提供新的思路。

1 资料与方法 1.1 资料

1.1.1 研究人群及组织样本

本研究纳入11例临床患者病理资料，其中男8例、女3例；患者平均年龄（58.82±9.67）岁；1例患者家族中曾患类似疾病，余10例无遗传病史；5例有吸烟史；7例有饮酒史；中段食管鳞癌患者8例，上段和下段食管鳞癌患者分别为1例和2例，排除肿瘤位置位于贲门者（胃食管结合部肿瘤病理及治疗目前暂无确切研究结果，加入可能会影响研究结果）；肿瘤组织分型中，高分化2例、中分化6例、低分化3例；所有患者肿瘤分期均为可手术的Ⅰ期或Ⅱ期，其中Ⅰ期患者8例、Ⅱ期患者3例。术前对患者肿瘤大小、分期、肺功能、心功能进行评估，本研究中患者临床及病理分期标准为2013年AJCC分期。

根据术前病理活检进行筛选，对入选患者严格追踪观察，术后病理活检结果确定最终是否纳入研究。癌组织取自患者肿瘤部位，且显微镜下复查可见明显异形细胞；癌旁组织取自远离瘤体≥5 cm的位置，且在显微镜下复查时未观察到肿瘤细胞。

1.1.2

细胞EC9706细胞系购于中南大学湘雅医学院细胞库，选取传代少于6月的细胞，培养使用RPMI1640培养基；10%北美胎牛血清；1%双抗，5%CO₂、37℃恒温培养。

1.1.3 主要试剂及仪器

CCK-8（Sigma, USA）、血清（Boehringer-Ingelheim company）、胎牛血清（Biological Industries, Israel）、Transwell小室（Costar, USA）、Matrigel（Gibco, USA）、TRIzol（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、ant-P53、ant-Akt和ant-Mdm2抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin鼠抗购自北京中杉金桥公司。过表达病毒及低表达病毒均由美国赛业公司合成构建。

1.2 方法

1.2.1 HIPK3表达量与食管鳞癌发生关系预测

通过GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）下载食管鳞癌患者相关数据，其中食管鳞癌患者共182例，非癌患者286例。对食管鳞癌患者HIPK3的表达量行数据分析，同时对不同分期的食管鳞癌患者的HIPK3的表达量进行数据分析。

1.2.2 过表达及低表达CircHIPK3食管鳞癌细胞株的构建及检测

将食管鳞癌EC9706细胞以5×10⁵个/毫升的密度接种于6孔板中，每组设2个平行孔。对照组加入等体积PBS，12 h后分别更换新鲜培养液，于37℃, 5%CO₂, 95%湿度环境中继续孵育。两天后收集细胞，用嘌呤霉素筛选。试验共分四组，高表达组、高表达对照组、低表达组和低表达对照组，见表 1。

1.2.3 细胞增殖实验

取对数生长期的转染细胞，0.25%的胰酶进行消化制成单细胞悬液，CCK-8法进行细胞计数。以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔板中并继续孵育，第2、3、4天分别于每孔加入10 μl CCK-8，37℃孵育2 h后用酶标仪测450 nm波长处吸光度值。

1.2.4 细胞迁移实验

在24孔板中每孔接种1×10⁵个细胞，加入0.1%BSA-RPMI1640，将Transwell小室置于24孔板中，加入细胞悬液100 μl。36 h后取出小室，甲醛固定，结晶紫染色，擦去滤膜内表面细胞。计数穿过滤膜的细胞数，每膜计数5个随机不同视野，每组设3次重复。

1.2.5 细胞侵袭实验

在滤膜内表面涂基质胶形成人工重组基底膜，其余步骤同迁移实验。

1.2.6 细胞凋亡实验

取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.7 qRT-PCR检测CircHIPK3的表达情况

TRIzol提取细胞总RNA，依据反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA，反应条件为37℃，15 min；85℃，5 s。GAPDH作为内参，反转录得到的cDNA作为模板按照qRT-PCR试剂盒说明书配制10 μl的PCR反应体系，见表 2，反应条件为：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。测Ct值，基因的相对表达量采用2^-ΔΔCt表示。

1.2.8 预测下游调控miRNA种类

通过生物信息学分析的方式，对CircHIPK3基因的下游miRNA和调控通路进行分析，然后再分别通过TargetScan 7（http://www.targetscan.org/mamm_31）、miRBASE（http://www.mirbase.org/）、miRDB（http://mirdb.org/）和DIANA（https://academic.oup.com）四种软件，使用Venn图法，取四种软件预测miRNA的交集进行验证，再通过单一数据库对下游miRNA进行评价预测。

1.2.9 Western blot检测CircHIPK3细胞相关蛋白的表达

RIPA提取蛋白，蛋白浓度与5×SDS蛋白上样缓冲液以1:4比例混合，煮沸变性后，10%的SDS-PAGE分离样品，将蛋白转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，将膜与一抗室温孵育2 h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，暗室中加入ECL试剂，X线片曝光，显影和定影。在ImageQuant 350电泳凝胶成像分体系统中曝光拍照，并借助Image J软件对吸光度值进行分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白吸光度值/GAPDH蛋白吸光度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS24.0对实验数据进行分析，并用GraphPad Prism 6.0作图。运用t检验对两组数据进行比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 HIPK3与食管鳞癌的关系

通过对生物信息数据的分析，发现HIPK3高表达的食管鳞癌患者，生存率显著低于HIPK3低表达患者。对不同分期食管鳞癌患者的HIPK3表达进行分析，发现早期食管鳞癌患者的HIPK3表达较低，而晚期食管鳞癌患者的HIPK3表达较高，见图 1。

2.2 CircHIPK3的表达在癌组织和癌旁组织中的差异

CircHIPK3在18例样本中明显高表达，其中高表达的癌组织（n=11）占所有高表达组织的61%，表达量明显高于癌旁组织（P < 0.005）。

2.3 CircHIPK3的异常表达对EC9706细胞增殖的影响

CCK-8结果发现：在CircHIPK3高表达时，肿瘤细胞的增殖速度明显加快，低表达的CircHIPK3肿瘤细胞增殖明显被抑制。即pcDNA3.1b-circ > pcDNA3.1b > NC > shRNA，见图 2。

2.4 CircHIPK3对EC9706细胞迁移能力的影响

研究结果发现CircHIPK3高表达的EC9706细胞迁移能力高于高表达对照组（P < 0.001）；CircHIPK3低表达EC9706细胞的迁移速度明显减慢（P < 0.001），见图 3。

2.5 CircHIPK3对EC9706细胞侵袭能力的影响

研究结果发现CircHIPK3高表达的EC9706细胞侵袭能力高于高表达对照组（P < 0.001）；而CircHIPK3低表达的EC9706细胞侵袭能力明显低于低表达对照组（P < 0.001），见图 4。

2.6 CircHIPK3的表达和EC9706细胞凋亡的相关性

CircHIPK3高表达的EC9706细胞的凋亡速度小于高表达对照组（P < 0.001）；而CircHIPK3低表达的EC9706细胞凋亡速度较低表达对照组增快（P < 0.001），见图 5。

2.7 CircHIPK3和P53-Akt-Mdm2通路蛋白表达相关性

本研究使用Venn图法对四种数据库进行分析，发现CircHIPK3影响的下游miRNA主要包括hsa-miR-302e；hsa-miR-520a-3p；hsa-miR-520e；hsa-miR-520b；hsa-miR-520c-3p；hsa-miR-520d-3p；单一数据库对CircHIPK3和miRNA的通路进行分析（CircHIPK3和miRNA的相关关系评分见表 3），发现其主要功能的实现与p53-Akt-Mdm2通路相关。对四种CircHIPK3不同表达的食管鳞癌细胞的p53-Akt-Mdm2通路相关蛋白进行测定，结果发现：高表达的CircHIPK3细胞内的抑癌基因p53被明显抑制，而细胞内的Akt-Mdm2信号通路则处于激活状态，癌细胞增殖相关蛋白的表达量随之增加，其对癌细胞的影响较大，最重要的是导致癌细胞的生理过程包括增殖、迁移和侵袭以及相关癌症蛋白的表达增加，癌细胞的相关功能增强；反之，低表达的CircHIPK3则对癌细胞的功能有抑制作用，见图 6。

3 讨论

本研究发现CircHIPK3在11例食管鳞癌标本中和7例癌旁组织中呈上调趋势，4例食管鳞癌旁组织样本中表达下调。基于CircHIPK3表达存在显著差异，本研究在细胞层面对CircHIPK3在食管鳞癌中的表达情况进行了进一步试验，实验结果表明：CircHIPK3表达升高促进食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，而下调CircHIPK3表达具有相反的作用。有研究表明以上miRNA多与CD44因子和p53-Akt-Mdm2通路的表达相关^[10-13]。本研究通过生物信息学对CircHIPK3的下游调控基因及蛋白进行了进一步分析，并使用Western blot进行验证，结果发现，当CircHIPK3低表达时，抑癌基因p53被激活，Akt-Mdm2信号通路被抑制，其表达的相关p53-Akt-Mdm2通路蛋量减少，癌细胞的功能抑制。

研究者们通过对人体肿瘤组织的基因组测序发现，环状RNA在膀胱癌、肠癌、肝癌、肺癌等人体多种实体肿瘤中呈现特异性表达，且通过参与多种肿瘤相关蛋白如WNT和VEGF等的合成过程发挥作用^{[9, 14-15]}。Zheng等^[8]研究发现circHIPK3在多种癌症的癌组织和癌旁组织中差异稳定。此后，较多研究^{[9, 16-17]}也得到类似的结果。

肿瘤蛋白p53是抑癌基因的一种。p53基因在各种内外因素的作用下（包括物理辐射、化学污染、生物及病毒因素等多种因素）发生突变后，其空间构象随着改变，此时，p53基因失去了对细胞的正常调控，使细胞和组织癌变。研究表明，在所有恶性肿瘤中，该基因的突变率约50%^[18]。

丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）是一种原癌基因，在调控细胞功能方面发挥重要作用^[18-20]，且其对于肿瘤细胞的调节途径与p53完全相异；Mdm2是一种人体的癌蛋白，是p53基因的主要调节蛋白，Mdm2突变与p53突变不共存，可通过特异性结合p53阻断其生物学活性，与肿瘤的增殖密切相关^[21-22]。同时Akt可以稳定Mdm2蛋白的作用，协同Mdm2抑制p53活性^[23-25]。因此，我们推测CircHIPK3可能通过该通路调节食管鳞癌细胞的生理活性。

本研究首先通过慢病毒构建具有不同CircHIPK3表达水平的食管鳞癌细胞系，观察到p53-Akt-Mdm2信号转导途径中相关mRNA和蛋白的水平随CircHIPK3的表达不同而改变。在稳定过表达CircHIPK3的细胞中，Akt-Mdm2通路的作用被促进，同时抑癌基因p53作用被抑制，癌细胞的功能增强。CircHIPK3低表达则结果相反。

综上所述，本研究结果发现CircHIPK3促进人食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡，这可能通过调节p53-Akt-Mdm2信号通路来实现。因此，CircHIPK3存在作为食管鳞癌潜在靶点的可能性，但本研究对其具体作用通路和机制表述仍不明确，还需要更大样本和更深入的研究。

作者贡献

苟云久：论文撰写、实验指导

马继龙：实验操作

韩松辰：数据分析

金大成：收集临床标本

陈猛：资料检索

王兵：论文修改、图片处理

柏启州：论文修改及质量把控