0 引言

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，发病率呈迅速增长的趋势^[1-2]。化疗是治疗结肠癌的主要方法之一，5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil, 5-Fu）是用于治疗结肠癌的常用化疗药物，但经常会由于对药物产生耐药性，导致治疗失败^[3]，严重制约了5-Fu的临床疗效，因此，解决该问题将有利于提高结肠癌的治疗成功率。

那可丁（Noscapine, Nos）是一种从罂粟中分离出来的邻苯二甲酸异喹啉生物碱，通常被作为止咳药^[4]。研究发现^[5-6]Nos还是潜在的抗癌药物，可以影响肿瘤细胞的生物学行为。本研究利用反复大剂量结合药物浓度梯度法构建对5-Fu耐药的人结肠癌细胞株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu及SW480/5-Fu，用半数抑制浓度（50% Inhibitory concentration, IC₅₀）的Nos干预结肠癌细胞株HT-29、LoVo及SW480和耐药细胞株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu及SW480/5-Fu后，观察检测细胞生物学特性的变化。

1 材料与方法 1.1 材料

试剂：RPMI 1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；PBS、0.25%胰蛋白酶、PBST、MTT、DEPC处理水、兔抗p-glycoprotein、兔抗多药耐药相关蛋白（Multidrug resistance-associated protein, MRP）、兔抗肺耐药相关蛋白（Lung resistance-related protein, LRP）、兔抗P38、兔抗p-P38、兔抗GAPDH及HRP标记的山羊抗兔IgG均购自武汉华联科生物技术有限公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒和CycleTEST^TM Plus DNA Reagent Kit购自美国BD公司；TRIzol购自美国Ambion公司；反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司；SYBR Green PCR试剂盒购自美国KAPA Biosystems公司；PVDF转移膜、化学发光试剂购自美国Millipore公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、TEMED购自美国Sigma公司。仪器耗材：CO₂恒温培养箱购自美国Thermo公司；显微镜购自日本Nikon公司；流式细胞仪购自美国Beckman公司；荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；全自动化学发光分析仪购自上海天能。

1.2 方法

1.2.1 构建耐药株

取对数生长期的人结肠癌细胞株HT-29、LoVo和SW480，培养于含10 µg/ml 5-Fu的RPMI 1640完全培养液中，置于37℃、5%CO₂饱和湿度培养箱中诱导细胞24 h。当细胞出现凋亡时，用PBS清洗3次后于不含5-Fu的RPMI 1640完全培养液中培养。待细胞恢复正常生长后，加入浓度递增的5-Fu反复处理细胞，每次增加10 µg/ml，直到细胞被最大5-Fu浓度（40 µg/ml）处理后存活至少4天则视为耐药株构建成功^[7]。此次研究构建耐药株共历时10月，获得HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu耐药细胞株。撤药两周后，对耐药株进行处理观察生物学特征变化。

1.2.2 MTT法检测药敏性

将对数生长期的人结肠癌细胞株HT-29、LoVo及SW480和耐药株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu及SW480/5-Fu制成单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔约5×10³个细胞。在恒温培养箱中培养，待细胞贴壁后，分别加入浓度为0、10、50、100和150 μmol/L的Nos，继续培养24 h。取出3复孔，各孔加入10 µl MTT溶液（5 mg/ml），继续培养4 h。吸去上清液，加入150 µl二甲基亚砜溶解结晶物。最后使用酶标仪测定各组细胞在490 nm处的吸光度（OD）值，并计算Nos对各组细胞的IC₅₀。

1.2.3 实验分组

实验分为12组：HT-29 CON、LoVo CON和SW480 CON（亲本株对照组）；HT-29 IC₅₀、LoVo IC₅₀和SW480 IC₅₀（使用半数抑制浓度的Nos处理各亲本株）；HT-29/5-Fu CON、LoVo/5-Fu CON和SW480/5-Fu CON（耐药株对照组）；HT-29/5-Fu IC₅₀、LoVo/5-Fu IC₅₀和SW480/5-Fu IC₅₀（使用半数抑制浓度的Nos处理各耐药株）。

1.2.4 观察细胞形态变化

显微镜下观察人结肠癌亲本株、耐药株，以及经过半数抑制浓度Nos干预的亲本株和耐药株的细胞形态。

1.2.5 流式检测细胞周期

将经过分组处理24 h后的各组细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液，并离心收集。加入700 µl无水乙醇于-20℃冰箱中固定过夜。预冷PBS清洗后，加入100 µl RNase A（1 mg/ml）和400 µl碘化丙啶（50 µg/ml）溶液，避光染核10 min后，于流式细胞仪中检测DNA含量。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

将分组处理24 h后的对数生长期细胞取出，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，然后离心收集细胞。预冷PBS清洗后，将细胞重悬于200 µl结合缓冲液中，加入10 µl Annexin V-FITC，避光孵育10 min，再加入10 µl碘化丙啶避光孵育30 min后进行上机检测。

1.2.7 RT-qPCR检测P38及耐药相关蛋白的mRNA表达

经过分组处理后，取生长状况良好的细胞经PBS清洗，用TRIzol提取细胞总RNA。根据TaKaRa反转录试剂盒操作说明书将RNA反转录为cDNA，再进行RT-qPCR，引物序列见表 1。反应条件为：95℃变性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共39个循环。

1.2.8 Western blot检测P38及耐药相关蛋白表达

取生长状况良好的细胞，PBS清洗细胞后加入裂解液，然后提取细胞总蛋白。经过SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后，加入稀释后的一抗（兔抗p-glycoprotein：1:1000；兔抗MRP：1:1000；兔抗LRP：1:10000；兔抗P38：1:1000；兔抗p-P38：1:1000；兔抗GAPDH：1:5000），室温孵育1 h。PBST清洗后加入二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG），室温孵育1 h，再用PBS清洗，加入化学发光试剂进行化学发光显影，读取条带灰度值。

1.3 统计学方法

用SPSS22.0统计软件对上述实验数据进行统计学分析，两组之间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 测定药物IC₅₀

随着Nos药物浓度的升高，各组细胞的抑制率也随着升高，且亲本株HT-29 CON、LoVo CON和SW480 CON抑制率高于对应耐药株，见图 1。各组细胞的IC₅₀分别为：HT-29 CON细胞115.434 μmol/L，HT-29/5-Fu细胞657.474 μmol/L，LoVo CON细胞163.878 μmol/L，LoVo/5-Fu细胞526.336 μmol/L，SW480 CON细胞143.231 μmol/L，SW480/5-Fu细胞1064.294 μmol/L。各组细胞的IC₅₀将作为后续实验Nos干预细胞的浓度。

2.2 Nos对耐药细胞的形态影响

观察各组细胞形态，亲本细胞对照组形态大多呈梭形，耐药细胞对照组开始变圆钝，Nos干预后的耐药细胞出现皱缩，细胞体积变小，形态呈圆形，并出现漂浮态，分布松散，见图 2。

2.3 Nos对耐药细胞周期及凋亡的影响

未经Nos干预的5-Fu耐药株G₀/G₁期细胞数量多于亲本细胞。Nos对亲本细胞和耐药细胞的干预，也使细胞周期发生了明显的变化。经Nos处理后的亲本细胞和耐药细胞分别与其相应的对照组（CON）比较，IC₅₀ Nos处理后，处于G₀/G₁期的细胞数量显著增多（P=0.000），S期数量减少，说明Nos干预使细胞发生G₀/G₁期阻滞现象。且5-Fu耐药株和Nos的叠加作用，使得Nos干预后的耐药株G₀/G₁期细胞比例明显比亲本株多（P=0.024, P=0.003, P=0.000），见图 3。对细胞凋亡比例进行统计，发现与CON相比，Nos处理细胞24 h后，细胞凋亡率明显升高，见图 4。

2.4 Nos对细胞P38表达的影响

比较各组细胞的P38 mRNA及p-P38的蛋白相对表达水平发现，Nos干预过的细胞显著低于对照组（P < 0.01）（实验具体数据请扫描OSID码见附件）。IC₅₀ Nos处理的耐药细胞株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu P38及和p-P38的蛋白相对表达水平明显高于IC₅₀ Nos处理的亲本细胞株HT-29、LoVo及SW480（P < 0.05或P < 0.01），见图 5。说明耐药细胞株的P38表达高于亲本株，而Nos干预后会抑制P38的表达。

2.5 Nos对耐药相关蛋白表达的影响

与对照组细胞比较，IC₅₀ Nos干预后细胞的MRP、LRP及p-glycoprotein的mRNA和蛋白相对表达量显著降低（P < 0.01）（实验具体数据请扫描OSID码见附件）。与IC₅₀ Nos干预后HT-29、LoVo及SW480相比，IC₅₀ Nos干预后的HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu的MRP、LRP及p-glycoprotein的mRNA和蛋白相对表达量明显升高（P < 0.05或P < 0.01），见图 6。结果提示耐药株的耐药相关蛋白表达升高，而Nos干预后对耐药相关蛋白表达具有一定抑制作用。

3 讨论

丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases, MAPKs）在细胞表面到细胞核的信号转导过程中起重要作用，参与了细胞增殖、存活及凋亡的调节^[8]。MAPK由P38 MAPK、c-jun氨基末端激酶（c-jun amino-terminal kinase, JNK）和细胞外调节激酶（Extracellular regulated kinase, ERK）组成，并通过磷酸化的形式发挥作用^[9-10]。在多种肿瘤患者中都发现P38 MAPK水平的失调，Koul等^[11]对P38在肿瘤生物学中的影响进行分析，提示P38在细胞存活、分化/无分化、周期点控制、凋亡及耐药等方面都起着关键的作用，发挥什么样的作用取决于激活P38的类型和肿瘤细胞的特异性。研究发现，P38参与了结肠癌细胞对5-Fu的耐药，P38 MAPK信号通路抑制后可提高结肠癌细胞HT-29对药物的敏感度，降低相关耐药性因子的表达水平^[12]。本研究发现Nos显著抑制了耐药细胞株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu的P38的表达和磷酸化。

MRP可以将能量依赖性的药物排出体外，从而降低药物在细胞内的浓度，使化疗药物对肿瘤细胞的作用降低^[13]。相关文献^[14]结果显示多药耐药蛋白1（MDR1/P-glycoprotein/ABCB1）及多药耐药相关蛋白1（MRP1/ABCC1）表达上调会抑制药物对癌细胞的毒性作用。LRP的耐药机制可能是阻止药物进入细胞核，并能将药物排出细胞外，而且LRP与MRP同在一条染色体上，且位置相近，两者的表达可能具有相关性^[15]。于是，本研究进一步检测MRP、LRP及p-glycoprotein在各组细胞中的表达水平，发现这些与耐药相关的蛋白在Nos处理组显著受到抑制，说明IC₅₀Nos降低了HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu的耐药性。前期研究^[4]发现Nos使人结肠癌细胞株HT-29、LoVo和SW480阻滞于G₀/G₁期，本研究周期检测结果与文献一致，Nos干预后，耐药细胞株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu发生G₀/G₁期阻滞现象，耐药细胞的DNA复制周期比亲本细胞长，且细胞凋亡率增加，说明Nos不仅作用于人结肠癌亲本细胞，对耐5-Fu的结肠癌细胞也具有一定的毒性作用。

综上所述，Nos促进了5-Fu耐药的结肠癌细胞发生G₀/G₁期阻滞及凋亡，降低了耐药细胞的耐药性，可能是通过抑制P38的表达和磷酸化而发挥作用，具体的作用机制还需进一步深入研究。

作者贡献

韩峥、刘蒙、田霞：提出研究思路、设计研究方案，并参与实验过程、论文撰写

黄晓东、朱庆曦：分析实验数据，论文审核

谭洁、刘维洁、陈巍：收集资料，实施研究过程，论文修改

邹晓丽、蔡一珊、黄莎莎：参与课题设计及论文撰写