0 引言

宫颈鳞癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一, 发病率在女性恶性肿瘤中位居第二, 死亡率居第四位^[1]。目前手术、放疗、化疗是治疗宫颈鳞癌三大手段。大多数早期宫颈鳞癌患者治疗效果较好, 而晚期和复发的患者治疗方案有限并且治疗效果较差。因此, 寻找一种能够预测其发生发展的新型分子标志物作为治疗的新靶点, 逐渐成为研究热点。微小RNA（microRNA, 简称miRNA）是一种广泛分布在人体内的内源性非编码RNA, 转录后对靶基因的表达起调节作用, 在肿瘤发生、发展中起重要调节作用^[2]。近年来, 有研究表明miRNA可作为恶性肿瘤早期诊断及预后判断的生物学标志物^[2-6]。我们的前期研究发现：miR-1246在宫颈鳞癌组织与正常宫颈组织中表达存在差异^[7]; miR-1246能促进人宫颈鳞癌Siha细胞的增殖、侵袭、迁移, 可能是促进宫颈鳞癌发生发展的机制之一^[8-9]。本研究检测宫颈鳞癌患者、鳞状上皮内病变（CIN）患者、健康体检妇女血清miR-1246的表达水平并分析其表达与宫颈鳞癌临床病理特征的关系, 探讨miR-1246作为宫颈鳞癌早期诊断和术后恢复及复发监测的血清肿瘤标志物的价值。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集2016年3月—2016年12月在广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科住院确诊并接受治疗的80例宫颈鳞癌患者, 30例鳞状上皮内病变（CIN）患者及30例健康体检妇女为研究对象。80例宫颈鳞癌患者中, 11例淋巴结转移、13例脉管浸润、6例神经侵犯、3例切缘阳性、4例宫旁浸润, 其中8例复发（复发组）, 12例由于术后去外地诊疗或不愿配合治疗等原因失访, 60例患者在广泛性全子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术后完成随访。宫颈鳞癌患者年龄32~74（51±10.68）岁, CIN患者年龄67~33（48±8.46）岁, 健康体检妇女年龄32~53（46±5.01）岁。

宫颈鳞癌患者纳入标准：（1）确诊为宫颈鳞癌, 且符合国际妇产科联合会（FIGO）分期标准; （2）能够耐受广泛性全子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术者; （3）所有宫颈鳞癌患者治疗前未做化疗、免疫或放射等抗肿瘤治疗。本研究获得医院伦理委员会批准, 并与患者或家属签署知情同意书。

主要试剂：血清总RNA提取试剂盒（miRNeasy Serum/Plasma Kit）购自德国Qiagen公司; 所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司（中国）合成; 反转录试剂盒（Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit:638315）和荧光染料（TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ: RR820A）均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集

所有研究对象均于清晨采集空腹静脉血液5 ml, 加入促凝管, 4℃ 3 000 r/min离心5 min, 分离血清, -80℃保存待检。

1.2.2 血清总RNA的提取及RT-qPCR检测

血清提取按照miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒提取总RNA, 严格遵循操作步骤及注意事项。从血清中提取总RNA并检测了RNA的纯度, OD260/OD280: 1.8~2.1。cDNA的制备采用反转录试剂盒, 取约3.75 μl总RNA, 依照宝生物工程（大连）有限公司的反转录酶及产品说明书, 按反应条件37℃ 1 h, 85℃ 5 min进行反转录。反转录产物置于-20℃条件下保存。行RT-qPCR检测, 扩增体系为25 μl, 其中SYBR荧光染料预混液（2×）12.5 μl, 无酶水9.5 μl, cDNA模板2 μl, 上下游引物各0.5 μl。引物序列见表 1。反应条件为：95℃ 10 s、95℃ 5 s、60℃ 20 s（最后两步共计40个循环）。以管家基因U6为内参, 所有样品设三个复孔, 取Ct平均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件分析。计量资料采用（x±s）表示。两样本均数比较采用t检验, 多组均数比较采用单因素方差分析, miR-1246的表达水平与临床病理特征分析用卡方检验。P < 0.05为差异有统计学意义。以U6为内参, ΔCt=Ct_miR-1246-Ct_U6, 采用2^-ΔΔct法计算miR-1246的相对表达水平。对检测结果作图绘制ROC曲线, 计算曲线下面积（AUC）和标准误, 利用AUC评估miR-1246作为肿瘤标志物的诊断价值。结果判定AUC≤0.5为无诊断价值, 0.5 < AUC≤0.7为诊断准确性较低, 0.7 < AUC≤0.9为诊断准确性较好, AUC > 0.9为诊断准确性最高。

2 结果 2.1 miR-1246在宫颈鳞癌患者与CIN患者、健康妇女血清标本中表达的比较

宫颈鳞癌组患者血清miR-1246的表达量（0.322±0.383）与CIN组（0.096±0.130）、健康妇女组（0.038±0.028）相比, 差异有统计学意义（P=0.000442, P=0.000013）; 三组间比较差异有统计学意义（χ²=12.83, P=0.000009）; CIN组与健康妇女组相比, 差异无统计学意义（P=0.421）, 见图 1。结果表明宫颈鳞癌患者血清中miR-1246的表达水平明显高于CIN患者和健康妇女。

2.2 血清miR-1246的表达在宫颈鳞癌诊断中的价值

结果表明, ROC曲线下面积为0.791（95%CI: 0.709~0.872）; 当截断值为0.517时, 其敏感度为67%, 特异性为85%, 见图 2。

2.3 宫颈鳞癌患者血清miR-1246的表达与临床病理特征的关系

以宫颈鳞癌患者血清miR-1246的表达中位数0.547为界值, 分为40例低表达组（< 0.547）和40例高表达组（≥0.547）。宫颈鳞癌患者血清miR-1246表达水平与患者年龄、浸润深度、神经侵犯、切缘阳性、宫旁浸润无关（P > 0.05）, 但与肿瘤大小、FIGO分期、淋巴结转移、脉管浸润密切相关（P < 0.05）, 见表 2。

2.4 宫颈鳞癌患者术前与术后血清miR-1246表达情况

60例宫颈鳞癌患者术后1周、术后1月与术前血清miR-1246的表达水平的比值分别为0.60±0.46、0.42±0.28, 术后1月与术后1周比值为0.33±0.28, 三组间差异有统计学意义（χ²=13.56, P=0.000000）, 见图 3。检测宫颈鳞癌患者术后1月和健康妇女血清miR-1246表达水平, 两者间差异无统计学意义（P > 0.05）。结果表明, 宫颈鳞癌患者血清miR-1246含量于术后逐渐降低, 并于术后1月恢复到健康妇女水平, 见图 4。

2.5 术后复发宫颈鳞癌患者血清miR-1246的表达

8例复发宫颈鳞癌患者miR-1246的相对表达水平（1.122±0.355）与健康妇女（0.075±0.027）比较, 差异有统计学意义（t=8.309, P=0.000067）, 表明复发宫颈鳞癌患者血清miR-1246表达水平比健康妇女明显升高, 见图 4。

3 讨论

微小RNA（microRNA, 简称miRNA）是一种小分子非编码单链RNA, miRNA被认为与肿瘤的发生发展有密不可分的关系。近年来, 一些学者已经开始研究miRNA与宫颈癌的关系, 发现了miRNA的异常表达与宫颈癌的发生、发展、转移密切相关, 推测miRNA可作为宫颈癌早期诊断、预后监测的潜在标志物。同时, 血清miRNA较稳定, 能长期反复冻融, 可作为肿瘤的生物标志物, 为肿瘤诊断提供一种非损伤性的方法。其中, Sun等^[10]采用RT-qPCR方法检测血清miR-425-5p的表达水平, 认为miR-425-5p可作为宫颈癌的潜在预后生物标志物。Zhao等^[11]探讨了治疗前血清miRNA-20a水平与宫颈癌患者临床病理特征的关系, 认为miRNA-20a可作为检测宫颈癌早期淋巴结转移的标志物。hsa-mir-92a也被认为与宫颈癌的不良预后相关, 血清hsa-mir-92a水平可作为宫颈癌诊断的独立标志物^[12]。另有研究发现血清miRNAs（miR-16-2*, miR-195, miR-2861, miR-497）可作为检测宫颈癌的新型非侵入性生物标志物^[13]。

微小RNA1246（miR-1246）于2008年在人胚胎干细胞中被发现, 其在多种肿瘤中呈高表达, 被认为可能是一种癌基因。Zhang等^[14]发现, miR-1246促进肺上皮祖细胞的快速增殖和未分化表型, 在肺癌患者组织中表达升高, 并且发挥促进非小细胞癌进展的作用; 另有研究发现miR-1246在高级别卵巢浆液性癌中表达升高^[15]。miR-1246也被研究证实在食管鳞癌中呈高表达^[16]。

本课题的前期研究发现：在细胞水平上, miR-1246对人宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖、侵袭、迁移能力有促进作用, 并且下调miR-1246后可抑制宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖以及侵袭能力, 双向验证认为miR-1246可能是促进宫颈鳞癌发生发展的机制之一^{[8, 17]}。在组织层面上, 我们通过RT-qPCR技术检测了宫颈鳞癌患者组织中的miR-1246表达水平, 结果表明miR-1246在宫颈鳞癌组织中高表达^[18]。因此, 本研究在前期研究的基础之上, 进一步探讨血清miR-1246作为宫颈鳞癌血清肿瘤标志物的临床意义。

本研究发现, miR-1246在宫颈鳞癌患者血清中的表达水平明显升高, 通过ROC曲线分析显示, miR-1246对于区分宫颈鳞癌具有良好的特异性和敏感度。在其他的一些肿瘤中, miR-1246大多数为高表达, 而且也被发现可作为血清诊断的肿瘤标志物。Moshiri等^[15]采用数字PCR方法检测肝细胞癌患者血浆中miR-1246的表达, 认为miR-1246可作为肝细胞癌潜在的诊断性生物标志物; 研究发现miR-1246可作为食管鳞癌新的诊断和预后生物标志物^[16], 另有学者发现miR-1246可作为高级别浆液性卵巢癌的一种诊断生物标志物^[19], 与本研究结果相似。本研究发现miR-1246的高表达与FIGO分期、肿瘤大小、淋巴结转移、脉管浸润密切相关。miR-1246高表达组相对于低表达组, 肿瘤直径更大、FIGO分期期别更晚、淋巴结转移阳性更多、脉管浸润阳性更多。说明miR-1246也可能作为预测宫颈鳞癌患者预后差异的潜在生物学指标。手术治疗后, 血清中miR-1246的表达水平逐渐降低, 一月后表达水平恢复正常, 说明血清miR-1246表达水平可监测宫颈鳞癌患者术后恢复情况。复发患者血清中miR-1246的表达水平较健康妇女升高, 提示宫颈鳞癌患者血清miR-1246的表达水平可监测患者的复发情况。因此, miR-1246可能是宫颈鳞癌早期诊断、术后恢复和术后复发监测的潜在血清肿瘤标志物。

综上所述, 血清miR-1246有望成为新的宫颈鳞癌血清肿瘤标志物, 为宫颈鳞癌的早期诊断和术后恢复及监测提供更为便捷有效的检测手段。进一步深入研究miR-1246在宫颈鳞癌中的作用机制, 对于揭示其发生发展的分子生物学机制有重要意义。

(致谢: 感谢广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤二区全体医护人员为本课题研究收集血清标本提供帮助)

作者贡献

冯一鸣：课题设计、血清收集、实验操作、数据分析、文章撰写

姚德生：课题设计、血清收集、指导文章

卢 艳：课题设计、血清收集

龙 颖：课题设计、血清收集、实验材料的整理分析

伍光腾、董婷婷、徐勋：实验材料的整理分析