0 引言

据国家癌症中心数据显示，2014年全国女性乳腺癌新发病例约27.89万例，占女性恶性肿瘤发病的16.51%；发病率为41.82/10万，死亡率为9.90/10万，近10年乳腺癌死亡率呈上升趋势^[1]，乳腺癌相关研究对于促进女性健康具有积极意义。全外显子组仅占人类基因组的1%~2%，其中与人类疾病有关的基因突变约占85%。全外显子测序是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，该方法相对其他测序方法有效率高、成本低等优势^[2]，在当今基因研究中应用广泛，在包括乳腺癌在内的各种复杂疾病研究中发挥着重要作用，特别是运用新一代测序技术进行基因组DNA序列分析和风险预测为乳腺癌的研究做出了积极贡献，本文就全外显子测序在乳腺癌的发病机制、诊断及治疗中的研究进行综述，了解其在解析乳腺癌发病分子机制等方面的研究进展。

1 全外显子测序在乳腺癌发病机制中的研究进展 1.1 乳腺癌遗传易感性与基因突变的研究

乳腺癌具有明确的遗传易感性，大部分遗传性乳腺癌表现为家族聚集性，约占所有乳腺癌的5%~10%^[3]。除了经典的BRCA家族外，Kechagioglou等^[4]研究发现，PTEN与乳腺癌发生有关。Noh等^[5]使用外显子组测序，发现了XCR1、DLL1、TH、ACCS、SPPL3、CCNF和SRL7个基因变种存在于无BRCA突变的乳腺癌家族。也有研究表明家族性乳腺癌的遗传易感性可以是民族特异性的。Kim等^[6]通过全外显子测序研究认为埃及乳腺癌家族的遗传易感性可能与其他疾病人群不同，并支持全面筛查当地疾病家族。总之，全外显子测序能更为精确地分析乳腺癌遗传易感基因，不断有明确的易感基因被发现，为分析乳腺癌易感基因多态性及其相互作用提供了新的思路和方法。

基因突变是肿瘤发生的基础，大量学者从基因突变的角度研究乳腺癌的发病机制。Banerji等^[7]报告了103例来自墨西哥和越南不同亚型乳腺癌患者的DNA全外显子组序列，以及22例乳腺癌/正常配对的全基因组序列。除了确认PIK3CA、TP53、AKT1、GATA3和MAP3K1的复发性体细胞突变之外，还发现CBFB转录因子基因的复发性突变和RUNX1的缺失；确定了富含三阴乳腺癌的复发性MAGI3-AKT3融合体，其缺乏雌激素和黄体酮受体以及ERBB2表达。基因突变类型包括错义突变和移码突变等，关于乳腺癌的基因突变类型，Foo等^[8]研究报告了一种新型PALB2变体c.104T > C（p.L35P），研究结果将L35P确定为PALB2中的第一个致病性错义突变。Radmanesh^[9]等对6例家族性乳腺癌白血病患者的基因组DNA样本进行了外显子组测序，并发现了一个移码突变APOBEC3B*c.783delG，其显示出与乳腺癌适度相关。基因突变还会影响肿瘤转移。Ng等^[10]对来自9位患者的原发性乳腺癌和同步远处转移瘤进行了两次解剖学上不同的核心活组织检查，伴有转移性疾病的患者进行了高深度的全外显子测序。在原发性和转移性沉积物之间观察到基因组差异，共有体细胞突变的中位数为60%（范围为6%~95%）。影响上皮-间质转化相关基因（包括SMAD4、TCF7L2和TCF4（ITF2））的致病性突变被限制或富集于转移性病变中。

全外显子测序研究基因突变在罕见乳腺癌的发病机制中也有重要作用。Dieci等^[11]将全外显子测序应用于三种不同的罕见乳腺癌亚型，对29例微乳头、23例化生和27例多形小叶乳腺癌进行了整个外显子和有针对性的测序。微乳头乳腺癌表现出与常见乳腺癌相当的特征：PIK3CA、TP53、GATA3和MAP2K4是最常见的突变基因。化生型乳腺癌呈现TP53（78%）和PIK3CA（48%）突变的高频率，并在KDM6A（13%）（一种参与组蛋白去甲基化的基因）上反复发生突变。27例样本中有8例样本在多形性小叶癌中表现出PIK3CA（30%）、TP53（22%）和CDH1（41%）的高突变率，并且表现为PYGM（一种参与糖原代谢的基因）高表达。多形性小叶癌的测序鉴定出PYGM的高比例改变。这些发现强调了糖原代谢在乳腺癌进展中的作用。

总之，外显子测序是进行基因突变检测直观、准确、高效的方法之一，能够检测出乳腺癌患者基因突变的类型和位置，对于部分罕见的亚型，外显子测序更有针对性，能够进行更加透彻的研究。

1.2 乳腺癌异质性研究

乳腺癌具有异质性，全外显子测序在其异质性研究中也有重要意义。肿瘤的异质性研究有较大难度，通过外显子测序，能够探寻突变与异质性发生的相关性，对异质性在乳腺癌发病中的作用能够进行深入研究。Ma等^[12]从癌症基因组图谱评估了916名女性乳腺癌患者。使用突变等位基因肿瘤异质性（MATH）算法来测量肿瘤内异质性（ITH）并探索其与临床参数和多组学数据的相关性。研究结果揭示了ITH在乳腺癌中的临床特征和遗传的相关性。Kato等^[13]采用全外显子测序分析乳腺癌患者肿瘤组织的体细胞突变、肿瘤浸润淋巴细胞的T细胞受体β库谱，以及15个不同位点的免疫相关基因的表达，结果表明肿瘤中高体细胞突变负荷与免疫原性抗原的数量相关，功能性激活肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）具有更高的细胞溶解活性。乳腺癌有复杂的肿瘤异质性，可能与诱导癌症特异性TIL密切相关并影响肿瘤中的免疫微环境。

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度异质性和侵袭性的疾病，由于肿瘤的异质性，难以发现有效的生物标志物来识别这些患者。Jiang等^[14]对MD安德森癌症中心（MDACC）的29例TNBC病例进行了全外显子组测序，分析显示AR和FOXA1调节网络中的突变（其中BRCA1起关键作用）使患者对蒽环类/紫杉烷化疗的敏感度显著增高，提出将BRCA缺陷与增加的克隆变异负荷联系起来，并显著增强TNBC的化疗敏感度。提示我们可以通过针对遗传异质情况优化的新型高通量分析策略来研究罕见变异在癌症发展中的作用。

1.3 乳腺癌转移中的研究

乳腺癌发展到后期会转移，转移的途径难以分析。通过外显子测序，能够分析肿瘤的转移过程是如何进行、转移过程中是否有新的突变产生，还能分析肿瘤转移的起源等。Krøigård等^[15]将全外显子组测序和靶向深度测序应用于来自6名转移性雌激素受体（ER）阳性乳腺癌患者的26个连续样品。结果指出了三种不同的转移途径，包括转移的线性进展、线性和平行进展向转移的共同发生、转移—转移播种。另外还在研究中发现突变，仅在转移灶中发现的突变影响CREBBP和PPP2R1A基因，其已经作为癌症相关基因包含在癌症体细胞突变目录（COSMIC）癌症基因调查列表。该研究首次报道了通过乳腺癌进展的连续步骤，建立转移克隆起源，揭示转移性扩散的复杂模式，详细描述突变的演变。Savas等^[16]研究发现原发性与转移性疾病及不同转移部位间的亚克隆结构具有显著的异质性，在每种情况下均发现转移性交叉播种，并且治疗推动了亚克隆多样化，强调了形成转移性乳腺癌基因组的各种机制以及详细研究晚期疾病的价值。

2 全外显子测序在乳腺癌诊断中的研究进展 2.1 诊断标志物研究

全外显子测序可用于乳腺癌诊断的标志物研究。Heidary等^[17]对来自58名转移性乳腺癌患者的74份血浆DNA样本进行分析，并且通过全基因组测序鉴定血浆中的拷贝数变化，对原发肿瘤、转移瘤和循环肿瘤细胞进行了全基因组、外显子组或靶向深度测序，研究结果表明转移性乳腺癌患者循环肿瘤DNA（ctDNA）的动态范围显著不同，可使用ctDNA作为预测性和预后性生物标志物。Lesurf等^[18]研究发现，与基底样或正常亚型乳腺癌患者相比，HER2阳性患者更有可能完全缓解，而ERBB2和GRB7基因融合的病例不容易完全缓解。

2.2 诊断方法的研究

Wang等^[19]开发了一种称为nuc-seq的全基因组和外显子组单细胞测序方法，对来自ER阳性乳腺癌和三阴性导管癌的单个正常细胞核和肿瘤细胞核进行测序，同时进行单核拷贝数分析，可用于乳腺癌的诊断。Kriegsmann等^[20]设计并验证了乳腺癌特异性基因芯片，用于基于半导体的测序，证明在常规环境中乳腺癌靶向热点测序是可行的，并能产生可靠的、临床上有意义的结果。

2.3 全外显子测序对于诊断技术的评价

Fusco等^[21]对乳腺腺样囊性瘤进行全外显子测序分析，并探讨分子分析在乳腺腺样囊性瘤诊断中的作用（区别显示MYB表达的良性肿瘤和CYLD基因突变）。结果表明组织病理学和分子学方法的整合可以帮助区分低恶性潜能和良性乳腺肿瘤三重阴性表型。Kim等^[22]采用全外显子测序数据评估拷贝数变化（CNA）估计工具（ExomeCNV、CoNIFER、VarScan2、CODEX、ngCGH、SaasCNV和falcon）的一致性和敏感度，结果显示SaasCNV具有最高的一致性（65.0%）、敏感度（69.4%）和特异性（89.1%）。可改进CNA检测算法，准确解释人类癌症的全外显子测序结果。总之，可以通过外显子测序研究乳腺癌的肿瘤标志物，在测序的基础上研究乳腺癌的诊断方法，提高诊断的准确率，评价诊断结果的可靠性。

3 全外显子测序在乳腺癌治疗中的研究进展

目前研究较多的是对三阴性乳腺癌的治疗。Pfefferle等^[23]利用小鼠Trp53缺失的乳腺移植瘤模型进行人和鼠肿瘤之间的比较。研究鉴定了五种潜在的个体化药物靶基因，它们是鼠类和人类基底样肿瘤中自发扩增的基因座：Cul4a，Lamp1，Met，Pnpla6和Tubgcp3。使用克唑替尼抑制Met导致Met扩增的鼠肿瘤完全消退。该研究将Met鉴定为小鼠肿瘤的药物靶标，从而鉴定与人类基底样乳腺癌子集潜在的共同驱动因子，也强调了比较基因组研究对于发现个性化药物靶点的意义，为进一步研究关键肿瘤信号通路提供了临床前模型。Liu等^[24]通过全外显子测序，鉴定Trp53单独或与Brca1结合驱动的TNBC小鼠模型中的体细胞遗传改变。全外显子测序和人类TNBC上RNA测序的组合将用于TNBC治疗的精确药物指导，支持针对个体肿瘤的遗传学治疗方案，这些方案与正在进行的NCI-MATCH、My Pathway实验和ESMART临床试验方法类似。Lesurf等^[18]研究认为可通过全外显子测序，预测对化疗和曲妥珠单抗治疗无效的HER2阳性乳腺癌患者。总之，通过外显子测序，鉴定乳腺癌治疗的药物靶标，有利于乳腺癌的精准治疗。

4 展望

全外显子测序技术的进步使医学研究走向了“基因医学”时代，该技术在乳腺癌中的应用也越来越多，主要有以下几点：（1）由于与疾病相关的大部分功能性变异基本集中在染色体的外显子区，全外显子测序可以有效发现乳腺癌的致病基因或易感基因；（2）发掘肿瘤转移机制，全面揭示疾病的发生发展机制；（3）研究乳腺癌在基因水平上的临床诊断，开发新的诊断技术，早期准确诊断乳腺癌并预测疾病预后；（4）寻找乳腺癌的治疗靶点，促进疾病的个体化治疗。

然而，外显子测序依然存在局限，如部分肿瘤是由于基因结构变异导致，并不会改变碱基序列；少量基因变异在染色体末端的重复区域内；部分疾病是由于线粒体基因突变导致；内含子基因突变引起疾病等均无法通过外显子测序监测；部分疾病是由于基因之间的相互作用导致，单纯的基因突变并不能完全解释疾病。

在今后的研究中，可充分利用外显子测序的优点为乳腺癌的研究提供帮助。

作者贡献

金卫华：  文献查阅及论文撰写

张瑞涛：  指导及审校