0 引言

骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是骨中常见的原发性侵袭性肿瘤，好发于儿童和青少年^[1-2]。像其他肉瘤一样，OS是一种间质细胞来源的恶性肿瘤^[3]，它通常是局部侵袭性的，早期有全身转移倾向^[4]。目前的治疗策略包括术前化疗（新辅助化疗）、手术切除和术后（辅助）化疗。化疗后在无转移的局部性骨肉瘤患者中5年无瘤生存率达到60%~70%，但是中晚期骨肉瘤患者的5年生存率则低于50%^[5]。研究表明，遗传变异在骨肉瘤发生与发展的不同阶段起着重要作用，肿瘤抑制基因突变与致癌基因活化与骨肉瘤密切相关^[6]。因此，了解骨肿瘤发生的分子机制，以及验证骨肉瘤的新治疗靶点对于制定骨肉瘤的治疗有着重要意义。

本研究通过转染siRNA的方法敲低U2OS细胞中Skp2的表达，研究骨肉瘤中Skp2对细胞生长、凋亡以及细胞周期的影响；同时探讨Skp2对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的调控作用。进一步检测沉默Skp2是否影响E-cadherin、Akt及周期蛋白p21和p27。初步探讨Skp2对骨肉瘤细胞生物学行为的影响，阐明Skp2作为骨肉瘤治疗靶点的意义。

1 材料与方法 1.1 细胞及试剂

人骨肉瘤U2OS购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，将其置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。MTT（3-（4, 5-二甲苯并噻唑-2-基）-2, 5-二苯基四唑溴化物）为美国Sigma公司产品。抗-p21、抗p27、抗-E-cadherin、抗-Akt和抗-pAkt多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。Tubulin及Skp2多克隆抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。Lipofectamine 2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司。Annexin V/PI双染试剂盒购自北京碧云天试剂有限公司，钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein-AM）染色试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 细胞转染

将生长状态良好的U2OS细胞接种于6孔板中，培养大约24 h，待细胞融合度达到70%~80%后，用Lipofectamine 2000分别转染Skp2 siRNAs及对照siRNA。Skp2 siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成。转染5~8 h后弃培养液，再加入2 ml新鲜的完全培养基，继续培养48~72 h。收集细胞检测基因沉默效率用于后续实验。

1.3 RT-qPCR检测

按照TRIzol试剂使用说明提取转染细胞的RNA并反转录合成cDNA。Skp2引物序列为：上游：5' -GCT GCT AAA GGT CTC TGG TGT-3' ，下游：5' -AGG CTT AGA TTC TGC AAC TTG-3；GAPDH引物序列为：上游：5' -ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3' ，下游：5' -CAG TGA GCT TCC CGT TCA G-3' ，以GAPDH表达作内部参照。通过SDS软件分析Skp2基因表达，溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增，用2^-ΔΔCt方法分析Skp2基因表达变化。

1.4 蛋白质印迹分析

收集处理的细胞，加入适量的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，用Bradford法检测蛋白质浓度并制样。以相同的量将蛋白样品加载到每个泳道中，用SDS-PAGE凝胶电泳。将经SDS-PAGE分离的蛋白质转移到NC膜上。室温下用5%牛奶封闭NC膜1 h。洗NC膜3~5次，分别用Skp2、p-Akt（ser473）、p21、p27、E-cadherin和Tubulin等第一抗体进行孵育，4℃过夜。洗膜，然后再与辣根过氧化物酶标记的二级抗体进行室温孵育90 min左右。用ECL显影液将目的蛋白表达条带显影于X光片上。用Quantity One软件扫描目的蛋白表达条带进行灰度分析，对比Tubulin蛋白表达量获得目的蛋白的相对表达量，最后对结果进行统计分析。

1.5 MTT测定

收集对数期U2OS细胞将细胞制成细胞悬液，以5×10³个/孔接种到96孔板中，培养过夜。转染siRNA，每组设5个复孔，继续培养48和72 h。每孔加0.5%MTT溶液，继续培养4 h。加入150 µl DMSO，置摇床上室温低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，利用酶标仪检测OD490 nm处各孔的吸光度。分别在48 h和72 h通过MTT测定细胞活力，确定Skp2对骨肉瘤细胞中细胞增殖的调节作用，从而评估Skp2 siRNA转染骨肉瘤细胞增殖的状况。

1.6 细胞凋亡测定

将转染细胞培养至6孔板中，48 h后收集细胞并用PBS洗涤，加入500 μl结合缓冲液悬浮细胞，再先后加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl（PI），避光反应15 min，用FACScan流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.7 细胞周期分析

将转染siRNA的U2OS细胞及对照细胞接种到培养皿中培养48 h。收集细胞在磷酸盐缓冲液中洗涤一遍，再用70%冷乙醇固定12 h。次日，用冷PBS洗涤细胞，以1×10⁶个/毫升重悬于PBS中。用核糖核酸酶A（RNase A, 0.1 mg/ ml）于37℃下处理固定的细胞20~30 min。1 000 r/min离心5 min收集细胞，将细胞重新悬浮于荧光染料PI（50 μg/ml）中，使用FACScan流式细胞仪评估细胞周期分布并进行分析。

1.8 Transwell侵袭和迁移实验

细胞侵袭实验：将转染细胞按5×10⁵个/毫升悬浮于无血清DMEM培养基中，取0.2 ml细胞悬液加入到事先辅有Matrigel的Transwell上室中；下室中加入0.5 ml含有10%胎牛血清的DMEM培养基；将Transwell板放到培养箱内，培养24 h。用镊子取出Transwell小室，留在膜上层未穿膜的细胞用棉签轻轻擦去。将膜取出，底面朝上放到24孔板小孔内，加入适量Hanks缓冲液，再加入4 μg/ml Calcein-AM，将侵入Matrigel基质膜及侵入未铺Matrigel的Transwell小室膜的细胞在37℃下染色1 h。在荧光显微镜下进行拍照，各组细胞随机选取6个不同的视野，对穿过膜的侵袭细胞进行计数。

细胞迁移实验：将转染细胞铺在不加Matrigel的Transwell小室膜上，其余操作步骤与细胞侵袭实验相同。

1.9 统计学方法

实验结果采用SPSS17.0统计软件进行处理，计量资料主要采用均数±标准差进行描述，用t-test分析比较Skp2 siRNA转染组和NC siRNA转染组之间的差异。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 骨肉瘤细胞U2OS中转染Skp2 siRNA后对Skp2表达的影响

RT-qPCR结果显示，Skp2 siRNA转染U2OS细胞48 h后，三条siRNA序列都显著下调Skp2 mRNA水平，其中siRNA3序列下调效果最为显著（0.21±0.03, P=0.0001），与对照组相比，Skp2在U2OS细胞中的敲除效率均达到70%左右，见图 1A。Western blot结果表明三条siRNA均能有效的敲低Skp2蛋白表达，而siRNA3在U2OS细胞中沉默效果为79%，强于siRNA1的59%和siRNA2的74%，见图 1B。因此，后续实验沉默Skp2的表达时均转染siRNA3。

2.2 沉默Skp2后对骨肉瘤细胞增殖的影响

研究表明，通过降低Skp2水平可抑制多种癌细胞增殖。MTT结果表明，在转染Skp2 siRNA 48 h，U2OS细胞生长受到一定程度的抑制，抑制率为34%（P=0.0065），见图 2A；而72 h后U2OS细胞生长则被显著抑制，抑制率为64%（P=0.0003），见图 2B。

2.3 沉默Skp2对骨肉瘤细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测结果显示，沉默Skp2表达可触发U2OS细胞凋亡。与对照组的凋亡率5.45%及转染NC siRNA对照组的5.50%相比，转染Skp2 siRNA的细胞凋亡率增加到18.56%，见图 3。

2.4 沉默Skp2对骨肉瘤细胞周期的影响

流式细胞术结果显示，Skp2 siRNA转染组细胞出现典型的G₀/G₁阻滞。沉默Skp2后，G₀/G₁期细胞比例从阴性对照组的44.54%，增加到U2OS细胞的76.35%，见图 4。结果表明沉默Skp2表达可诱导骨肉瘤阻滞在G₀/G₁期。

2.5 下调Skp2表达对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响

将转染Skp2 siRNA的细胞铺在含Matrigel胶的小室膜上，培养大约16 h后，将侵入Matrigel基质膜的细胞用4 μg/ml Calcein-AM在37℃下染色1 h。荧光显微镜拍照，对随机选择的6个视野进行统计，Transwell实验结果表明沉默Skp2显著削弱了U2OS细胞的侵袭能力（23.33±4.71, P=0.0002）；将转染Skp2 siRNA的细胞铺在不含Matrigel胶的Transwell小室膜上时，迁移到膜背面的细胞明显减少，表明沉默Skp2同样会抑制U2OS细胞的迁移能力（74.71±8.82, P=0.0021）。结果表明，沉默Skp2的表达显著削弱了U2OS细胞的体外迁移和侵袭能力，见图 5。

2.6 骨肉瘤细胞沉默Skp2对其下游分子的影响

Western blot分析显示，沉默Skp2可增加骨肉瘤细胞中E-cadherin的表达，升高约2.86倍（2.86±0.07, P=0004）。而沉默Skp2后周期相关蛋白p21和p27的表达也显著升高，分别升高约1.79倍和2.16倍（1.79±0.06, P=0.0192; 2.16±0.05, P=0.0124），见图 6。表明Skp2在一定程度上可通过靶向p21与p27参与细胞周期调控。沉默Skp2降低了骨肉瘤细胞中p-Akt活性形式分子，p-Akt的表达下降约50%（0.5±0.04, P=0.0027），见图 6。

3 讨论

Skp2在多种肿瘤中都有高表达，如淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌等^[7]。国内外大量研究发现，Skp2在多种人类肿瘤发生中主要发挥癌基因作用，Inuzuka等发现Skp2通过泛素化破坏E-钙黏素而增强细胞迁移^[8]。Skp2蛋白促进泛素介导的Foxo1水解，在肿瘤发生中发挥关键作用^[9]。而通过敲除小鼠肿瘤细胞中Skp2的表达则可逆转由p19 Arf或PTEN蛋白损失引起的肿瘤^[10-11]。条件性敲除小鼠Skp2的下调可抑制T细胞谱系和B细胞谱系的淋巴瘤，还可以抑制骨髓、肝脏、乳腺和前列腺中肿瘤的生长^[12-14]。鼻咽癌中Skp2高表达与预后不良相关，并且失活Skp2蛋白可通过p21cip/WAF和p27kip促进鼻咽癌细胞衰老^[15]。抑制Skp2的表达有助于抑制肿瘤细胞的生长等癌细胞特性^[16-17]，但Skp2在骨肉瘤细胞中的作用仍相对模糊。有报道表明骨肉瘤U2OS细胞中Skp2与Cks1紊乱可导致FoxM1表达下调，从而抑制骨肉瘤U2OS细胞生长，进一步导致细胞生长周期阻滞与p21、p27表达水平增加^[18]。同时，FoxM1可调节SCF/SKP2-CKS1泛素链接酶复合物等调节细胞周期基因的转录。此外，GLI2是Hedgehog信号通路中的一个关键驱动因子，通过siRNA敲低该分子可以抑制骨肉瘤细胞生长，并伴随细胞周期负调节分子p21的增加及细胞周期促进分子cyclin D1、Skp2和磷酸化Rb的减少而将细胞阻滞在G1期。相反，过表达GLI2则可通过上调骨肉瘤细胞中Skp2的表达，而促进细胞增殖、加速细胞周期进程。裸鼠移植瘤模型结果表明，敲低GLI2抑制了骨肉瘤在体内的生长^[19]。使用环巴胺（Cyclopamine）特异性的抑制Hedgehog信号途径中另一关键分子Smoothened（SMO），可减缓骨肉瘤细胞生长，上调p21，下调cyclin D1、Skp2等细胞周期促进分子^[20]，并且使用SMO shRNA持续沉默SMO的表达，可抑制骨肉瘤细胞在体内和体外的生长^[20]。当用γ-分泌酶抑制剂及阻断Notch信号通路后，由于cyclin D1、Skp2等细胞周期促进分子表达降低，从而抑制了骨肉瘤细胞体外及体内生长^[21]。这些研究表明Skp2在调节骨肉瘤细胞生长中起关键作用。

本研究中我们观察到Skp2沉默后抑制了骨肉瘤细胞生长、促进凋亡、诱导周期阻滞，并抑制细胞侵袭和迁移能力。Skp2需要通过靶向其底物如p27、p21、p57与FOXO1等来体现其致癌功能，本研究还检测到Skp2沉默后显著上调了p21、p27和E-cadherin的表达。相关研究表明，Akt可直接结合Skp2，促进Skp2由细胞核向细胞质迁移，进而激活Skp2功能^[22]，并且研究发现Skp2可刺激人乳腺癌细胞中Akt活化^[23]。本研究中，沉默Skp2降低了骨肉瘤细胞中活性形式分子p-Akt的表达，进一步地深入研究将有助于确定Skp2对骨肉瘤细胞中Akt活化的调节作用。本研究直接证实了Skp2在骨肉瘤细胞中的生物学功能，因此，失活Skp2基因将成为潜在的治疗骨肉瘤患者的有效方法。

作者贡献

丁 路：细胞实验、分子生物学实验和撰文

孙荣鑫：分子生物学实验

白靖平：实验设计及指导