0 引言

结肠癌是世界上男性常见的第三大肿瘤，女性常见的第二大肿瘤^[1]，是所有肿瘤类型中第四大致死原因^[2]。尽管在近20年内对结肠癌的筛查、诊断以及治疗方法上取得不错的进展，但早期患者5年生存率仅为69%，晚期患者5年生存率降为12%^[3]。因此需要新型有效的治疗方法来提高患者的生存率。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）在细胞氧化还原中起到核心作用，也是多种细胞生物学过程必需的第二信使^[4]。烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）是催化NAD+合成的限速酶，已经证实在多种恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、甲状腺癌、结肠癌以及血液系统肿瘤中高表达^[5]。由于肿瘤细胞对NAD+的高需求，抑制NAMPT表达可显著抑制肿瘤细胞增殖，因此，NAMPT被认为是抗肿瘤治疗的分子靶点^[6]。本研究通过组织标本及TCGA数据库证实NAMPT在癌组织中高表达并通过细胞系证实沉默NAMPT后细胞增殖能力减弱。同时，运用生物学信息对NAMPT的理化性质、蛋白结构及生物学功能进行预测分析，以期对结肠癌的诊疗提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 材料

人结肠癌细胞系SW480购于美国模式培养物集存库（ATCC）；NAMPT及对照的siRNA购于广州市瑞博生物科技有限公司；组织标本选自2017年4月—2018年4月鄂州市中心医院手术切除的结肠癌及其癌旁组织46例；从TCGA数据库获取结肠癌患者数据；NAMPT及内参GAPDH抗体购于武汉三鹰有限公司；NAMPT上游引物AATGTTCTCTTCACGGTGGAAAA，下游引物ACTGTGATTGGATACCAGGACT及GAPDH上游引物GAGCGAGATCCCTCCAAAAT，下游引物ACTGTGATTGGATACCAGGACT由武汉擎科创新生物科技有限公司合成；四季青胎牛血清及RPMI 1640培养液、TRIzol总RNA提取试剂、反转录试剂盒购于武汉拜意尔生物有限公司；CCK8试剂盒购于索莱宝科技有限公司；UniProt网站（http://www.uniprot.org/）获取NAMPT序列登录号（人P43490）及对应的氨基酸序列。

1.2 方法

1.2.1 qPCR法检测结肠癌患者组织中NAMPT mRNA的表达

从TCGA数据库下载结肠癌患者RNA-Seq基因信息，比较正常组织及肿瘤组织mRNA表达差异，同时比较同一患者癌组织与癌旁组织mRNA差异。

收集我院手术切除结肠癌患者癌与癌旁组织标本；利用TRIzol试剂行总RNA提取（NANODROP 2000测定浓度及纯度），并将样品反转录为cDNA，利用SYBR Green PCR mix在ABI StepOne Plus中进行qPCR，条件：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 15 s共40个循环。mRNA的表达用GAPDH校准。用2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.2.2 siRNA转染结肠癌SW480细胞系

于37℃、5%CO₂培养箱中，用含10%RPMI1640培养液培养细胞。按说明书转染细胞：分别用无胎牛血清RPMI1640培养液稀释siRNA及Entranster-R4000，充分混匀两种稀释溶液，室温静置15 min。将混匀液体加入含细胞的培养液中，充分混匀后培养24 h，收集细胞并提取蛋白，应用Western blot技术验证蛋白沉默效果：配10%SDS-丙烯酰胺胶，电泳80 V 30 min，120 V 90 min，转印蛋白至活化的PVDF膜，90 V 90 min。TBST漂洗5 min×3次，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗孵育过夜，TBST漂洗5 min×3次后用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，TBST漂洗5 min×3次后加ECL液显影。

1.2.3 CCK8测定结肠癌SW480细胞增殖和活力

利用NAMPT-siRNA干扰SW480中NAMPT表达后，接种细胞于96孔板，每孔2 000个细胞，每组设置4个复孔。应用CCK8在不同时间段（0、24、48、72、96 h）检测细胞的增殖能力，转染NC-siRNA的SW480作为对照组，利用酶标仪（TECAN，Infinitef50）在450 nm处测吸光度OD值。

1.2.4 NAMPT生物信息学分析

利用在线软件ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析NAMPT的主要理化性质：氨基酸组成、分子式及分子质量、平均疏水值、等电点、不稳定系数等；ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析NAMPT亲/疏水性；Jpred4.0（http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4/）分析NAMPT的二级结构；SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）分析NAMPT的三级结构；ScanProsite（https://prosite.expasy.org/）分析NAMPT的功能结构域；NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/?term=）分析NAMPT的保守结构域；Genecards（http://www.genecards.org/）预测NAMPT细胞定位；String（https://string-db.org/cgi/input.pl）分析与NAMPT相互作用蛋白及生物学功能。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism6软件分析TCGA及实验数据，比较采用两独立样本t检验；qPCR结果及TCGA数据库中结肠癌与正常标本数据以均数±标准差表示；P < 0.05差异有统计意义。

2 结果 2.1 结肠癌及癌旁组织中NAMPT的表达情况

数据库共检测到286例结肠癌及41例癌旁组织mRNA表达的信息，其中匹配癌与癌旁病例数为25例；结果证实与正常的结肠组织比较，癌组织中NAMPT水平显著升高，差异具有统计学意义（P=0.0014, P=0.0418），见图 1A。利用本院组织标本，采用qPCR技术对46对组织标本行基因表达检测，结果显示：结肠癌组织中NAMPT水平显著高于癌旁正常组织（P < 0.0001），见图 1B，结果进一步证实TCGA数据库基因表达。

2.2 Western blot技术验证siRNA转染SW480细胞后NAMPT的表达及CCK8测定细胞增殖情况

Western blot检测结果显示：沉默NAMPT后，结肠癌细胞系SW480表达NAMPT明显降低，见图 2A；同时，CCK8结果显示：与对照组相比较，沉默NAMPT后，SW480细胞增殖活力明显降低，差异具有显著意义（P < 0.001），见图 2B。

2.3 NAMPT的理化性质

利用ProtParam在线软件对NAMPT蛋白分析，其氨基酸组分分布见表 1。分析NAMPT理化性质显示：NAMPT蛋白由491个氨基酸组成，相对分子质量55 521.16 Da，蛋白总原子数7 835个，预测分子式C₂₅₁₈H₃₉₁₀N₆₅₄O₇₄₅S₈。其带正电荷氨基酸略多于带负电荷氨基酸，理论等电点6.69，不稳定系数为35.48，在哺乳动物体内半衰期为30 h，其疏水性指数平均值为-0.429，脂肪族指数为86.31，为不稳定酸性亲水性蛋白质。进一步利用ProtScale对NAMPT的亲/疏水性进行分析。该蛋白最大亲水区域位点在44号位（Score=-3.133）, 最大疏水区域位点在325号位（Score=1.833），其疏水指数平均值为-0.429，与ProtParam在线软件预测结果一致，为亲水性蛋白，在细胞中可能处于水溶状态。

2.4 人NAMPT蛋白结构及结构域

利用Jpred4.0软件对NAMPT二级结构进行预测，其二级结构有14个α螺旋，17个β折叠；其中参与α螺旋氨基酸有190个（占比38.70%），参与β折叠氨基酸有85个（占比17.31%）。同时利用软件对NAMPT三级结构进行预测，结果GMQE评分0.97（接近1表示准确性高），见图 3。进一步对NAMPT功能结构域和保守结构域进一步分析，预测结果显示NAMPT并无功能结构域，其仅有一个保守结构域，见图 4。

2.5 NAMPT亚细胞定位及相互作用蛋白

利用Genecards对NAMPT蛋白亚细胞定位预测分析可知：NAMPT蛋白在细胞外、细胞核以及胞质中均有大量表达，此外，在线粒体、过氧化物酶体、质膜、细胞骨架以及内质网也有分布，见图 5。这表明NAMPT可能是分泌型蛋白，可参与细胞间或细胞内重要的生物学功能。同时利用String数据库得到蛋白质相互作用网络图，见图 6，其中与NAMPT可能发生作用的蛋白主要是SIRT1、ARNTL、NPAS2、CLOCK和LEP等，生物过程（GO）提示其参与的生物学活动主要包括参与NAD+生物合成、昼夜节律、应激、代谢反应及衰老等，进一步证实其在肿瘤生物学发生发展中扮演的重要角色。

3 讨论

目前针对结肠癌的治疗主要包括手术、分子靶向治疗、免疫治疗、过继细胞疗法、疫苗治疗、溶瘤病毒治疗等，其中部分治疗尚处于临床前期试验^[3]。近年，许多新型的分子靶向药物取得了较大的进展，如伊马替尼治疗胃肠道间质瘤^[7]，利妥昔单抗治疗血液系统肿瘤^[8]，表皮生长因子受体治疗非小细胞肺癌^[9]，赫塞汀治疗乳腺癌^[10]等。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）在细胞氧化还原中起到核心作用，也是多种细胞生物学过程必须的第二信使^[4]。已经证实NAMPT与肿瘤有密切的联系，其表达高低与肿瘤治疗、患者不良预后相关。相比在正常组织中，NAMPT在结肠癌^[11]、卵巢癌^[12]、前列腺癌^[13]等组织中高表达。在胃癌^[14]、子宫内膜癌^[15]NAMPT高表达也提示患者不良预后。

我们的工作也证实NAMPT在结肠癌组织中高表达。在结肠癌细胞系SW480中，沉默NAMPT导致细胞增殖能力减弱。对于哺乳动物来说，NAMPT对NAD+的生物合成至关重要。在肿瘤治疗中，通过抑制剂抑制NAMPT活性作用于NAD+可导致肿瘤细胞减少糖酵解、核苷酸合成和ATP生成^[16]，这使得针对NAMPT的研究具有很强的转化应用前景，针对其靶位的研究成为理想中的抗肿瘤方向。当前针对NAMPT的两种抑制剂FK866以及CHS828已进入临床试验，但由于导致患者血小板减少而限制其临床应用^[17-18]。这说明我们对NAMPT的理化性质及功能研究的还不够深入。

NAMPT在肿瘤治疗中展现了较好的应用前景，本研究利用生物信息学方法及qPCR技术证实NAMPT在结肠癌组织中高表达，并证实高表达NAMPT在肿瘤生长增殖中起到重要作用。利用生物信息学方法对NAMPT的理化性质及生物学功能进行研究，初步推测其在结肠恶性肿瘤发生中的重要作用，通过其抑制剂针对肿瘤细胞的代谢，为我们进一步针对结肠癌患者抗肿瘤治疗提供新思路。