0 引言

非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌总病例的85%，5年生存率为10%~15%^[1]。NSCLC患者最常见的治疗障碍是肿瘤复发和转移，因此即使手术切除依旧保持高水平的死亡率。虽然研究表明，手术切除辅助顺铂化疗可以提高NSCLC患者的生存质量，但化疗对患者造成的不良反应仍不利于患者康复^[2]。因此，寻找新的NSCLC治疗靶点和药物是当前肺癌研究的方向。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（cystatin C, Cys C）是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，又称CST3，能抑制组织蛋白酶B/H/L/V蛋白酶活性，特别能强力抑制组织蛋白酶B。作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的家族成员，由CST3基因编码，在炎性反应和肿瘤发生过程中起着重要的作用。现已在食管癌^[3]、乳腺癌^[4]、肾细胞癌^[5]、前列腺癌^[6]、多发性骨髓瘤^[7-8]和卵巢癌^[9]相关研究中证实，Cys C在这些患者体液中水平升高。Cys C被证明在结直肠癌患者中与高风险的转移和侵袭有关^[10]。另有研究表明，Cys C在NSCLC患者体液中增加^[11]。然而，迄今为止还未有报道证明Cys C与NSCLCs的侵袭和迁移的关系。因此，本研究主要是探索Cys C对NSCLC细胞A549侵袭和转移的影响。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

非小细胞肺癌A549细胞购自美国ATCC；培养基F-12K、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒Direct-zol^TM RNA MiniPrep kit购自北京天漠科技有限公司；脂质体转染试剂盒Lipofectamine RNAiMAX Kit和NCode^TM miRNA第一链cDNA合成试剂盒购自美国Invitrogen公司；SYBR Green Master mix，RevertAid^TM H Minus First Strand cDNA合成试剂盒购自美国赛默飞世尔；所有一抗Cys C、VEGF、MMP-9、MMP-14、GAPDH购自美国CST公司。二抗山羊抗兔IgG-HRP购自美国Santa Cruz公司；Transwell小室及人工基底膜均购自美国BD公司。

1.2 Cys C shRNA构建

Cys C shRNAs的构建根据Tuschl^[12]的方法来完成。Cys C mRNA的shRNA靶向序列：5’-GCTCCTGCTGGCCATCCTG-3’，scramble shRNA序列：5’-TGCGAACGACTTCTTCGCC-3’，用作阴性对照。分别将两种shRNA寡核苷酸合成并插入psil2.1-U6载体。DNA测序验证结构的完整性。

1.3 细胞培养和转染

A549细胞F-12K培养于含10%胎牛血清（FBS）和1%双抗（青-链霉素）的F-12K培养液中，并置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养。在转染前1天，细胞在24孔板（每孔3×10⁵个细胞）中培养。质粒在转染前由SmaⅠ线性化。当细胞覆盖80%的培养皿时，根据文献所描述的方法^[13]，将400 ng的线性化质粒转染到孔中。sh-Cys C和阴性对照（scramble shRNA, sh-ctrl）用于转染细胞。使用脂质体2000将sh-Cys C-pRS（转染载体为pRS载体）转染进A549细胞。在含有400 μg/ml G418筛选培养基中培养两周，将存活的细胞用胰酶消化，稀释至密度约10~40个每毫升，取细胞悬液到96孔板，挑选单个细胞培养增殖，并筛选Cys C表达水平最低的细胞株。用该细胞株进行后续实验。分别用RT-PCR和Western blot检测Cys C mRNA和蛋白表达水平。

1.4 RT-PCR检测CysC mRNA水平

根据说明书，利用TRIzol试剂（TaKaRa，中国大连）从培养细胞中提取总RNA。根据PrimeScript RT试剂盒说明书，2 μg总RNA被用来合成cDNA（第一链）。使用SYBR Green Master mix和CFX 96 Real-time PCR系统（Bio-rad）扩增cDNA模板。GAPDH作为内参。数据分析根据比较Ct法，也称为2^-ΔΔCT方法。Cys C正向引物：5’-GCT CTT TCCAGA TCT ACG CT-3’；反向引物：5’-AGG CAGCCG ATG CTA CTA TT-3’；β-actin正向引物：5’-TAC ATG GCT GGG GTGTTG AA-3’；反向引物：5’-AAG AGA GGC ATCCTC ACC CT-3’。

1.5 Western blot检测蛋白表达水平

A549细胞被转染sh-Cys C和sh-ctrl后，收集细胞，用PBS洗涤两次，用细胞裂解液在冰上裂解细胞15 min；细胞悬液加入含有SDS的5×loading缓冲液在沸水中变性10 min。细胞总蛋白用BCA试剂盒检测。上样等量（20 μg）蛋白样品于SDS-PAGE分离胶上，并转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭后，PVDF膜孵育一抗（抗体稀释用5%脱脂奶粉溶解于TBST）4℃过夜。使用以下抗体：HIF1α（1:1 000）、GAPDH（1:1 000）。二抗用山羊抗兔IgG-HRP（1:5 000）。用ECL系统（德国Millipore）检测目标蛋白质。用Image J软件统计灰度值计算相对表达量。GAPDH作为上样量一致的参照，至少进行三个独立的重复实验。

1.6 CCK-8检测细胞增长情况

三组待测细胞：不转染（A549）、A549细胞转染sh-Cys C、A549细胞转染sh-ctrl。培养三组细胞24 h后，细胞被胰蛋白酶消化，并接种到96孔板，然后在37℃恒温培养箱中分别培养0、24、48、96 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1~4 h。最后用酶标仪检测各个时间段三组细胞在450 nm（OD₄₅₀）的吸光度，计算细胞增殖倍数。

1.7 Transwell检测细胞侵袭

将小室放入培养板中，上室加入300 μl预温的无血清培养基，使基质胶再水化，再吸去剩余培养液。首先，用含BSA的无血清培养基将各组待测的细胞制成1×10⁶个每毫升的悬液。然后，取细胞悬液100~200 μl加入Transwell上室中，并在下室中加入含500 μl含FBS的培养基。最后，在37℃下培养12~24 h，用0.5%的结晶紫对下室底部细胞进行染色，并用棉签除去下室内侧的细胞。最后显微镜下观察细胞形态并统计细胞数量。

1.8 划痕检测细胞迁移

将细胞密度为每毫升1×10⁶的细胞悬液加入到6孔板中，过夜培养至形成单层细胞。在单层细胞上用10 μl的枪头划横线，磷酸缓冲液（PBS）洗去脱落的细胞，重复2次。此时显微镜下拍照作为0 h的样，加入无血清培养基继续培养24 h后再取出拍照作为24 h的样，伤痕愈合率=24 h细胞间距/0 h细胞间距×100%。

1.9 统计学方法

采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计学分析，两两比较用独立的t检验，分析比较处理组与对照组之间增殖倍数、迁移与侵袭能力以及蛋白表达的差异。以上各组检验标准取P < 0.01为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 sh-Cys C抑制Cys C转录和翻译水平的表达

A549细胞转染sh-Cys C后，与对照组相比，Cys C表达在阴性对照sh-ctrl中表达无明显差异，sh-Cys C干扰后，Cys C表达明显被抑制包括mRNA水平和蛋白水平分别下调77%（P=0.003）和79%（P=0.003），见图 1。

2.2 Cys C sh-RNA抑制A549细胞增殖

为了验证Cys C对A549细胞生长的影响，本研究转染sh-Cys C到A549细胞，采用CCK-8检测细胞增殖能力的变化。sh-Cys C抑制A549细胞增殖，尤其在培养48、72、96 h后增殖抑制明显，与对照组相比增殖倍数降低，分别为1.7（P=0.005）、2.9（P=0.005）和3.3（P=0.003）；而sh-ctrl对A549细胞增殖无明显影响。说明Cys C shRNA可抑制A549细胞生长，见图 2。

2.3 Cys C sh-RNA抑制A549细胞侵袭

本研究采用Transwell法检测sh-Cys C转染A549细胞后侵袭能力的变化，与对照组相比，在阴性对照sh-ctrl中侵袭细胞数稍微下降，但差异无统计学意义；sh-Cys C组侵袭细胞数减少109个（P=0.003），见图 3。说明Cys C shRNA能抑制A549细胞侵袭。

2.4 Cys C sh-RNA抑制A549细胞迁移

为了探究sh-Cys C转染A549细胞后迁移能力的变化，本研究采用划痕实验检测A549细胞的迁移能力。划痕24 h后，sh-Cys C组的伤痕愈合率降低50%（P=0.007），见图 4，说明Cys C shRNA抑制A549细胞迁移。

2.5 Cys C shRNA下调MMPs和VEGF表达

为了进一步确定Cys C shRNA抑制A549细胞侵袭和迁移能力的作用，本实验检测金属蛋白酶MMP-9、MMP-14和血管内皮生长因子VEGF的表达情况，与对照组相比，在阴性对照sh-ctrl中蛋白表达无明显差异；结果显示sh-Cys C导致MMP-9、MMP-14和VEGF蛋白表达下调：MMP-9下调约5倍（P=0.004）、MMP-14下调约3.7倍（P=0.003）和VEGF下调约4倍（P=0.002），见图 5。

3 讨论

肺癌仍然是全球癌症死亡的头号杀手。2014年，估计有224 210例肺癌患者被确诊，其中大部分为非小细胞肺癌晚期^[14]。因此寻找新的诊断、治疗靶点具有非常重要的意义。

在肿瘤微环境中，蛋白酶活性异常对促进肿瘤的进展、增殖、侵袭和转移具有重要作用。高水平的蛋白酶表达与乳腺癌、肺癌、头颈部、结直肠癌和许多其他癌症的预后不良有密切的关系^{[3-4, 10-11, 15]}。Cys C能够抑制组织蛋白酶表达。研究发现，Cys C可能在肿瘤细胞中过度表达，导致循环水平升高^[5]。Cys C被认为在细胞外腔内的蛋白质稳态中发挥作用，抑制由死亡细胞释放的蛋白酶引起的不适当的水解降解^[16]。Cys C也可以从浸润的炎性细胞中释放出来，如巨噬细胞和嗜中性粒细胞^[17]。与健康者相比，卵巢癌^[15]和结直肠癌^[10]患者血清中Cys C的浓度相对较高。Cys C与肿瘤转移和侵袭有关^[18]，其表达与结直肠癌患者死亡的高风险相关。Cys C通过灭活组织蛋白酶活性从而抑制肿瘤细胞浸润和转移^[19-20]。半胱氨酸蛋白酶是Cys C的主要底物，半胱氨酸蛋白酶的活性在肿瘤转化的环境中经常出现紊乱^[21]。上述研究表明，肿瘤通常伴随Cys C异常表达，Cys C可以调控组织蛋白酶活性进而调控肿瘤的侵袭和转移。基于Cys C对非小细胞肺癌发展的积极作用，本研究采用RNA干扰（RNAi）下调Cys C表达。RT-PCR和Western blot结果表明，shRNA-Cys C转染细胞株中Cys C显著下调，Cys C的转录水平和翻译水平表达都被抑制。说明本研究shRNA Cys C设计良好，干扰效率较高，将该细胞株用于后续实验能充分表明Cys C沉默对非小细胞癌细胞A549的影响。shRNA已成为成熟的RNA干扰技术，广泛应用于生物学和医学生物学的研究中。CCK-8检测细胞增殖结果表明，Cys C沉默明显抑制NSCLC细胞A549的增殖，与前人研究一致，即Cys C沉默一定程度抑制食管癌细胞EC9706增殖^[3]。本文Transwell实验和划痕实验验证了Cys C沉默参与侵袭和转移抑制，与上述文献结果一致。其中，癌细胞的侵袭需要基质金属蛋白酶（MMPs）的激活，这些蛋白酶可以在局部降解构成基底膜和结缔组织的蛋白质，促进肿瘤细胞的转移。本研究表明，Cys C沉默可抑制MMPs和VEGF表达，从而抑制A549细胞转移。Cys C本身作为组织蛋白酶抑制剂，已经被证明通过调控组织蛋白酶活性进而调控肿瘤的侵袭和转移。本研究结果反面证明了Cys C的致癌作用，但其机制有待发掘。Cys C调控MMPs和VEGF表达可能是调控转移和侵袭的机制之一。

综上所述，Cys C下调可抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭，并下调MMPs和VEGF。本研究采用shRNA下调Cys C的表达，分析Cys C与NSCLC A549细胞的关系。结果提示，抑制Cys C表达可能抑制NSCLC细胞A549的发展。