肿瘤防治研究  2018, Vol. 45 Issue (12): 981-984
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引用本文 |
我国是全球食管癌高发地区，据估计，2013年全国食管癌新发病例数为27.7万例，死亡病例数约20.6万例[1]。食管癌分为鳞癌和腺癌两种亚型，亚洲90%的食管癌为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）。食管癌的病因和发生机制目前尚不完全清楚，虽然近年来在食管癌的诊治方面取得了一定的进展，但5年生存率仅有25%~30%[2]。深入研究ESCC发生、发展机制对食管癌的早期诊治和提高患者生存期具有重要的意义。微小RNA最早发现于1993年[3]，是一类长度为21~22个核苷酸内源性的非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA的3’端非编码区互补结合来调节其转录或降解，从而影响细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为[4]。越来越多的研究表明miRNAs在多种肿瘤的发生、发展及预后中发挥重要作用[5~6]。miR-181d位于19号染色体，是一个重要的基因表达调控因子[7]。近年来研究表明，miR-181d的异常表达与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关[8-10]。但是miR-181d在ESCC中的表达与预后的关系目前报道甚少。因此本研究通过检测miR-181d在ESCC及其相应癌旁组织中的表达，并进一步分析其与临床病理特征和预后的相关性，为寻找ESCC早期诊断和预后的生物标志物提供依据。
1 资料与方法 1.1 研究对象收集2011年8月—2013年4月在河南省肿瘤医院行手术切除并经病理确诊为ESCC组织及相应癌旁组织标本37例，组织标本离体后立即放入液氮保存。患者的临床、预后资料主要通过病历回顾和电话随访获得。末次随访时间为2016年8月。术后分期采用国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control, UICC）第7版食管癌分期标准[11-12]；组织学分级采用WHO病理分级标准[13]，1级为高度分化，2级为中度分化，3级为低度分化。本研究通过郑州大学附属郑州中心医院医学研究伦理委员会的批准，所有研究对象均签署知情同意书。
1.2 试剂与仪器TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，RNA反转录试剂盒、U6snRNA，实时荧光定量试剂盒均购自上海吉玛生物科技有限公司。无酶枪头、PCR管和EP管购自美国Axygen公司；其余试剂均为国产分析纯。NanoDrop微量核酸蛋白分析仪购自美国Thermo Fisher公司，7500fast实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。
1.3 实验方法根据说明书应用TRIzol试剂（Invitrogen, 美国）提取癌组织及癌旁组织总RNA，NanoDrop微量核酸蛋白分析仪（Thermo Scientific）检测RNA浓度及纯度。根据“Hairpin-itTM microRNA和U6 snRNA Normalization RT-PCR Quantitation Kit（Gene Pharma）”试剂盒说明书分别配制20 μl反应体系进行反转录实时荧光定量PCR反应。PCR扩增反应程序：预变性95℃ 3 min，PCR反应95℃ 12 s，62℃ 40 s，40个循环，设定统一的阈值，以PCR反应管内荧光信号到达设定阈值时经历的循环数（cycle threshold, Ct）分析结果，并取3次结果的平均值。以U6 snRNA管家基因作为内参，采用1号样本癌旁组织的平均Ct值作为标准对照，应用2-ΔΔCt方法计算样本中miR-181d的相对表达水平。以ESCC组织中miR-181d表达量的中位数为分界点将其分为低表达组和高表达组[14]。
1.4 统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计学分析，miR-181d在癌组织和癌旁组织中的表达水平差异分析采用Wilcoxon检验；Fisher精确检验分析肿瘤组织中miR-181d的表达水平与临床病理特征的关系；利用Kaplan-Meier生存曲线法及Log rank检验分析无病生存时间（disease-free survival, DFS）和总生存时间（overall survival, OS）。P值为双向性检验，检验水准α=0.05, P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miR-181d在ESCC组织中的表达水平RT-qPCR检测结果显示，与相应癌旁组织相比，miR-181d在89.2%（33/37）癌组织中相对高表达，且miR-181d在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织中的表达水平，差异有统计学意义（P=0.000），见图 1。
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| 图 1 RT-qPCR检测miR-181d在ESCC及对应癌旁组织中的相对表达量 Figure 1 miR-181d expression in ESCC and matched adjacent normal tissues detected by RT-qPCR |
以ESCC组织中miR-181d表达量的中位数为分界点将其分为低表达组和高表达组，分析两组与临床病理特征间的关系。结果表明，miR-181d表达水平与性别、年龄、病理分级、淋巴结转移，组织学分级，肿瘤部位均无明显相关性（P > 0.05），但与TNM分期相关（P < 0.05），见表 1。
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利用Kaplan-Meier法绘制生存曲线以及Log rank检验比较miR-181d高表达和低表达两组之间生存率的差异。结果显示：与miR-181d低表达组比较，miR-181d高表达组患者的中位OS和中位DFS均显著缩短（χ2=4.15, P=0.042; χ2 =3.94, P=0.047），见图 2~3。
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| 图 2 miR-181d高表达和低表达ESCC患者的生存曲线 Figure 2 Overall survival curves of ESCC patients with high and low miR-181d expression |
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| 图 3 miR-181d高表达和低表达ESCC患者的无病生存曲线 Figure 3 Disease-free survival curves of ESCC patients with high and low miR-181d expression |
miRNAs是一类进化保守、长约22个核苷酸的内源性非编码小RNA。它既可以作为癌基因，又可以作为抑癌基因，参与肿瘤的形成与演进，是肿瘤潜在的诊断和预后标志物及治疗靶点。食管癌是一种多因素作用，多基因参与，多阶段发展的复杂性疾病，其发生发展的分子机制仍未阐明。研究表明，miRNAs与ESCC的发生发展密切相关，如miR-375在ESCC中表达下调，且与远处转移和较低的总体生存率密切相关[15]。miR-508在ESCC中表达显著上调，是ESCC患者独立的预后因素[16]。
miR-181d是miR-181家族成员，在肿瘤发生发展中发挥重要的调控作用[17]。miR-181d在不同的肿瘤中表达情况不尽相同，在一些肿瘤中高表达发挥致癌作用，而在另一些肿瘤中却低表达发挥抑癌作用。这可能与肿瘤形成过程中一种miRNA可以调控多个靶基因，一个靶基因又可以被多种miRNA所调控，多条信号通路交错形成复杂的信息网络有关[18]。Guo等[19]发现miR-181d在结直肠癌组织中表达上调，敲低miR-181d通过影响糖酵解抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭；miR-181d通过直接靶向CRY2和FBXL3发挥癌基因的作用。与之相反，Huang等[8]发现181d在结直肠癌中低表达，且与患者较短的生存期相关；过表达miR-181d抑制结直肠癌细胞的生长和迁移；miR-181d通过靶向PEAK1发挥抑癌作用。Wang等[9]发现miR-181d在胶质瘤表达下调，可能通过靶向K-ras和Bcl-2发挥抑癌基因的作用且miR-181d的抑制肿瘤活性与K-ras相关的PI3K/AKT和MAPK/ERK途径有关。Zhang等[10]发现miR-181d在胰腺癌细胞系及组织中均高表达；下调miR-181d的表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和氟尿嘧啶抗性，并且抑制裸鼠移植瘤的生长；miR-181d通过靶向调节NKAIN2抑制胰腺癌的进展。Zhang[20]和Khalil[21]等发现miR-181d的表达水平与胶质瘤患者总生存期呈负相关，且通过靶向MGMT发挥作用。Li等[22]检测了16例ESCC患者癌组织及对应癌旁组织中miR-181d的表达，显示其在ESCC组织中的表达水平均显著低于癌旁组织（P < 0.05），且在ESCC进展中，miR-181d的分子机制可能是通过对癌基因DERL1的反向调控而起作用的。以上研究表明miR-181d在肿瘤发生发展中发挥重要的作用，且在不同肿瘤中的表达模式可能与其作用机制有关。
miR-181d在ESCC组织中的表达及临床意义报道甚少，为了明确miR-181d在ESCC中的作用，我们检测了miR-181d在37对ESCC组织及癌旁组织中的表达情况。结果显示miR-181d在89.2%（33/37）癌组织中相对高表达（P < 0.01）；这与Li等[22]报道的并不一致，分析原因可能如下：（1）两项研究中人群分布地域不一样，遗传背景有差异；（2）Li等检测的16对组织未显示临床病理资料，可能和本研究中的标本临床分期和术前治疗情况不同从而导致miR-181d在ESCC中的表达存在差异；（3）Li等发现在ESCC进展中，miR-181d通过靶向DERL1发挥作用，这可能和本研究中的作用机制不一致，从而导致其表达模式也不一样。
我们进一步分析ESCC患者miR-181d的相对表达水平与临床病理特征之间的关系，发现miR-181d的表达水平与性别、年龄、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、组织学分级、肿瘤部位均无明显相关性（P > 0.05），但与TNM分期相关（P < 0.05），即TNM分期为Ⅲ期的ESCC组织中miR-181d的表达量相对于TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期显著升高，说明miR-181d的表达上调可能促进了ESCC的进展；miR-181d的表达与组织学分级不相关，推测miR-181d的表达可能并不影响ESCC的分化；本研究并未证实miR-181d的表达与浸润深度、淋巴结转移等因素之间的关系，分析可能与样本量小及miR-181d不同表达水平的患者其临床病理因素分布不均衡有关。Kaplan-Meier生存分析结果显示，与miR-181d低表达组相比，miR-181d高表达组患者的总生存期和无病生存期显著缩短（P < 0.05）。
综上所述，miR-181d在ESCC组织中表达上调，且其表达与肿瘤临床分期及预后相关，这些结果表明miR-181d可能在食管癌的发展过程中起重要作用，可能成为食管癌早期诊断和预后的生物标志物。
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表1(Table 1)
