2018, Vol. 45文章信息
- miR-198靶向MAPK1调控宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡和侵袭
- miR-198 Targets MAPK1 to Regulate Proliferation, Apoptosis and Invasion of Cervical Cancer HeLa Cells
- 肿瘤防治研究, 2018, 45(12): 959-964
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2018, 45(12): 959-964
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2018.18.0537
- 收稿日期: 2018-04-19
- 修回日期: 2018-08-10
引用本文 |
2. 453000 新乡，新乡医学院第一附属医院感染科
2. Department of Infection, The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, China
宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤，是导致女性因癌症死亡的主要原因之一[1-2]。据统计，全球每年宫颈癌的新发病例高达529 800人，有275 100人死于宫颈癌[3]。发展中国家是宫颈癌的高发地区，超过80%的宫颈癌患者都出现在发展中国家[1]。放化疗及手术是目前治疗宫颈癌的常用方法，但并未能提高宫颈癌患者的生存率[4]。阐明宫颈癌发生发展机制是治疗宫颈癌的关键。近年来研究表明，微小型RNA（microRNAs, miRNAs）在调控细胞增殖、凋亡、分化和侵袭的过程中发挥重要作用，也可通过调控下游靶基因的表达影响癌症的发展[5]。miR-198是一类抑癌基因，在肝癌、胃癌及肺癌等多种癌症中表达下调[6-8]。上调miR-198表达可通过调控CDCP1表达抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭，还可通过下调FGFR1表达抑制肺癌细胞增殖、诱导肺癌细胞凋亡[9-10]。但miR-198在宫颈癌细胞中的表达及对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用还未见报道。本研究以宫颈癌细胞HeLa为对象，探讨miR-198对HeLa细胞增殖、凋亡和侵袭的作用及机制。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器RPMI1640培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；TRIzol试剂、TaqMan miRNA反转录试剂盒、TaqMan miRNA定量PCR试剂盒和Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；TaKaRa 6210A反转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-198 mimic购自美国Invitrogen公司；pcDNA3.0-丝裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1）重组质粒构建由北京BioGeek公司设计完成；抗核糖体S6激酶2（Ribosomal S6 kinase 2, RSK2）、c-Myc和c-fos抗体购自英国Abcam公司，货号分别为ab32123，ab39688和ab190289；辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）标记的山羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司。PCR扩增仪购自美国Applied Biosystems公司，CytoFLEX流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司，电泳仪、转膜仪和凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。
1.2 细胞培养人宫颈癌细胞系HeLa细胞购自中国科学院细胞库（上海）。用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液将HeLa细胞培养于37℃、5%CO2的恒温培养箱中，隔天换液一次。细胞融合度达到85%以上时进行传代培养。
1.3 细胞转染将细胞以每毫升1×106个的密度传代培养于12孔板中，24 h后取出细胞，根据转染试剂盒说明书用Lipofectamine 2000将miR-198 mimic和pc-MAPK1转染入HeLa细胞。转染4 h后更换正常细胞培养液继续培养。
1.4 qRT-PCR检测将细胞分为HeLa组、miR-198 scram组和miR-198 mimic组。用不含目标基因的载体转染miR-198 scram组细胞，miR-198 mimic转染miR-198 mimic组细胞。48 h后，用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，用TaqMan miRNA反转录试剂盒或Takara反转录试剂盒合成cDNA，用PCR进行扩增，根据试剂盒说明书用TaqMan miRNA定量PCR试剂盒或实时定量PCR试剂盒进行定量分析。实验所用到的引物均由上海生工设计合成。以GAPDH为参照，实验至少重复3次。
1.5 荧光素酶报告实验通过生物信息预测miR-198上存在MAPK1的结合位点，用RT-PCR扩增MAPK1上miR-198的结合位点基因片段，将该片段插入pMIR-REPORT荧光素酶载体，构建MAPK1野生质粒；再利用基因位点图片技术对结合位点的部分核苷酸进行突变，构建MAPK1突变质粒。用MAPK1野生质粒或MAPK1突变质粒与miR-198 mimic对HeLa细胞进行共转染，根据Dual Luciferase报告基因试剂盒说明书避光测定荧光素酶活性。
1.6 CCK-8检测细胞活性将细胞传代培养于96孔板中，随机分为HeLa组、miR-198 mimic组、pc-MAPK1组和mimic+pc-MAPK1组，用miR-198 mimic和pc-MAPK1分别或同时转染细胞后，分别于转染后的第0、1、2、3和4 d用MTT法检测细胞增殖活性。每孔加入10 μl CCK-8试剂，于37℃继续孵育2 h后用酶标仪检测细胞吸光度。
1.7 流式细胞术检测细胞凋亡用胰酶收集后转染细胞，将细胞密度调整至1×106个每毫升，用结合缓冲液清洗细胞三次后，将100 μl细胞加入到Falcon试管中，分别加入Annexin V和PI试剂，室温避光孵育15 min后，各试管分别加入400 μl结合缓冲液，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.8 Transwell检测细胞侵袭能力将转染后的HeLa细胞用无血清培养液培养12 h后，传代于基质胶包被的Transwell小室上层，细胞密度为每毫升1×105个，小室下层则加入含胎牛血清的正常细胞培养液。继续培养24 h后用无菌棉签刮去上层细胞，用结晶紫对小室下层细胞染色，每孔随机选取5个视野进行计数统计。
1.9 Western blot检测蛋白表达用RIPA裂解液提取各组细胞蛋白。用BCA试剂盒检测各组总蛋白浓度，调平蛋白浓度后，取等量蛋白用10%SDS-PAGE分离蛋白，半干法转移蛋白至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜2 h，随后加入一抗，4℃封闭过夜，第2 d弃去一抗，加入HRP标记的山羊抗兔二抗室温封闭1 h，滴加显色液显色，用凝胶成像系统获取蛋白质条带图片。
1.10 统计学方法用SPSS19.0对实验数据进行统计分析，实验结果用均数±标准差表示，组间差异用One-Way ANOVA检测。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miR-198过表达对宫颈癌细胞MAPK1表达的影响用miR-198 mimic转染细胞后，miR-198 mimic组细胞miR-198表达水平与miR-198 scram组比较明显升高（P=0.0012）；miR-198 mimic组细胞MAPK1 mRNA表达水平明显低于miR-198 scram组，差异有统计学意义（P=0.0004），见图 1。
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| **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with miR-198 scram group 图 1 miR-198 mimic对HeLa细胞miR-198和MAPK1 mRNA表达水平的影响 Figure 1 Effects of miR-198 mimic on mRNA levels of miR-198 and MAPK1 in HeLa cells |
生物信息预测结果表明，miR-198序列上存在MAPK1连续的结合位点。荧光素酶报告实验结果表明，miR-198 mimic能显著减弱MAPK1野生质粒的荧光素酶活性（P=0.011）；结合位点突变后，miR-198 mimic对MAPK1荧光素酶活性的调控作用消失，表明miR-198和MAPK1之间存在靶向调控关系，见图 2。
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| 图 2 荧光素酶报告实验检测miR-198与MAPK1之间的靶向关系 Figure 2 Relationship between miR-198 and MAPK1 detected by luciferase reporter assay |
miR-198 mimic转染细胞4 d后，miR-198 mimic组HeLa细胞增殖倍数显著低于HeLa组（P=0.016）；pc-MAPK1能显著促进HeLa细胞增殖（P=0.023）；与miR-198 mimic组比较，mimic+pc-MAPK1组细胞增殖倍数明显升高（P=0.019），见图 3。
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| *: P < 0.05, compared with HeLa group; #: P < 0.01, compared with miR-198 mimic group 图 3 CCK-8法检测miR-198过表达对HeLa细胞增殖的影响 Figure 3 Effect of miR-198 mimic on proliferation of HeLa cells measured by CCK-8 assay |
与HeLa组比较，miR-198 mimic组宫颈癌细胞凋亡率明显升高（P=0.001），pc-MAPK1组细胞凋亡率明显降低（P=0.0024）；与miR-198 mimic组比较，mimic+pc-MAPK1组HeLa细胞凋亡率明显降低（P=0.0031），见图 4。
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| **: P < 0.01, ***: P < 0.0001, compared with HeLa group; ##: P < 0.01, compared with miR-198 mimic group 图 4 流式细胞术检测miR-198过表达对HeLa细胞凋亡的影响 Figure 4 Effect of miR-198 mimic on apoptosis of HeLa cells detected by flow cytometry |
miR-198 mimic组HeLa细胞侵袭数显著低于HeLa组（P=0.026），pc-MAPK1组细胞侵袭数明显高于HeLa组（P=0.012），差异有统计学意义。与miR-198 mimic组比较，mimic+pc-MAPK1组HeLa细胞侵袭数明显升高（P=0.0036），见图 5。
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| *: P < 0.05, compared with HeLa group; ##: P < 0.01, compared with miR-198 mimic group 图 5 Transwell实验检测各组HeLa细胞侵袭能力 Figure 5 Invasion ability of cervical cancer HeLa cells measured by Transwell assay |
Western blot实验结果表明，miR-198高表达能显著抑制MAPK1下游蛋白RSK2、c-Myc和c-fos的表达（P=0.00045, 0.00020, 0.00016）；MAPK1能显著升高RSK2、c-Myc和c-fos的蛋白表达水平（P=0.00024, 0.00036, 0.00086）；pc-MAPK1能显著减弱miR-198 mimic对RSK2、c-Myc和c-fos表达的抑制作用（P=0.00048, 0.00022, 0.00031），见图 6。
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| ***: P < 0.001, compared with HeLa group; ###: P < 0.001, compared with miR-198 mimic group 图 6 Western blot检测RSK2、c-Myc和c-fos的蛋白表达水平 Figure 6 Expression levels of RSK2, c-Myc and c-fos detected by Western blot |
大量研究表明，miRNAs的异常表达与癌症的发生发展有关[11]。miRNAs通过调控下游靶基因的表达影响癌症的发展，可作为预测癌症发生发展的指标[12-13]。因此，寻找与癌症发生相关的miRNAs及下游靶标将有助于癌症的治疗。本研究中，我们发现miR-198在宫颈癌细胞中表达异常减少，上调miR-198表达能显著降低宫颈癌细胞MAPK1的mRNA表达水平，提示miR-198可能可靶向调控MAPK1的表达。MAPK1是MAPK的下游靶基因，主要参与细胞增殖、凋亡和侵袭的调控[14]。miRNAs可通过调控MAPK1活性影响癌细胞增殖、凋亡和迁移的过程[15]。为了验证miR-198与MAPK1的靶向调控关系，本研究首先采用生物信息预测两者之间的关系，表明miR-198序列上存在MAPK1连续的结合位点。荧光素酶报告实验进一步表明miR-198与MAPK1之间存在靶向调控关系，提示MAPK1是miR-198的下游靶基因。
miR-198是一类癌症抑制基因，在多种癌细胞中表达降低[11, 16-17]。在结肠癌中，miR-198的表达水平与患者的预后呈负相关，上调miR-198表达水平能通过抑制岩藻糖转移酶8的表达抑制结肠癌皮下瘤的生长[18]。miR-198还与胰腺导管腺癌患者的生存率及生存时间长短密切相关[19]。Wu等研究发现，miR-198在47例肺腺癌患者癌组织中表达水平均明显降低[20]。本研究发现，miR-198 mimic转染细胞后4 d，宫颈癌细胞增殖速度明显降低，提示miR-198过表达能抑制宫颈癌细胞增殖。同时转染pc-MAPK1后，宫颈癌细胞增殖速度有所升高，表明miR-198抑制宫颈癌细胞增殖与靶向抑制MAPK1表达有关。
研究表明，miR-198调控癌症发展还与诱导癌细胞凋亡有关。上调miR-198表达能通过调控纤维生长因子受体的表达诱导肺癌细胞增殖，从而降低肺癌细胞活性[10]。miR-198表达下调可降低胶质瘤细胞凋亡率，与胶质瘤患者较差的预后密切相关[21]。但miR-198对宫颈癌细胞凋亡的作用还未见报道。本研究采用miR-198 mimic转染细胞，用流式细胞术检测转染后宫颈癌细胞的凋亡率，发现上调miR-198表达能显著升高HeLa细胞凋亡率，表明miR-198能诱导宫颈癌细胞凋亡。上调MAPK1表达后，miR-198诱导细胞凋亡的作用明显被减弱，提示miR-198能通过抑制MAPK1表达诱导宫颈癌细胞凋亡，从而减缓宫颈癌发展。
大量研究表明，miR-198高表达能抑制癌细胞的转移[9, 22]。癌细胞转移是导致癌症恶化和癌症患者死亡的主要原因。上调miR-198表达能降低肝癌细胞侵袭和迁移能力，作用机制与抑制肝细胞生长因子、下调p44/42 MAPK活性有关[23]。miR-198还可通过靶向调控ROCK1的表达降低骨肉瘤细胞的转移率[24]。本研究发现，上调miR-198表达水平能显著降低宫颈癌细胞HeLa的侵袭能力，表明miR-198低表达可能是宫颈癌出现远端转移的机制之一。MAPK1能显著减弱miR-198 mimic对宫颈癌细胞侵袭能力的抑制作用，表明miR-198可通过抑制MAPK1表达来抑制宫颈癌细胞转移。
MAPK信号通路是调控细胞增殖、凋亡、分化和转录的基本信号通路，MAPK1是MAPK的下游靶标，又称为p42 MAPK、ERK2[25]。抑制MAPK1表达可抑制肺癌细胞侵袭和迁移，研究表明敲除MAPK1下游靶基因RSK2后，癌细胞侵袭和转移能力明显减弱[26]。此外，RSK2激活可直接诱导c-Myc和c-fos表达，诱导细胞增殖及癌症的发生[27]。Li等研究发现，长链非编码RNA促进前列腺癌细胞增殖和转移与下调miR-198表达促进MAPK1信号通路激活有关[28]。本研究发现上调miR-198表达能显著抑制MAPK1下游蛋白RSK2、c-Myc和c-fos表达，上调MAPK1表达后，miR-198对RSK2、c-Myc和c-fos蛋白表达的抑制作用明显减弱，进一步表明miR-198抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭，诱导癌细胞凋亡与靶向下调MAPK1的表达有关。
综上所述，miR-198可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和侵袭，并诱导宫颈癌细胞凋亡，作用机制与miR-198靶向调控MAPK1的表达有关。本研究阐明了miR-198在宫颈癌中的表达及miR-198对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用，并初步探讨了miR-198对宫颈癌细胞的作用机制，可能为宫颈癌的治疗提供了又一新的治疗靶标。
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