2018, Vol. 45文章信息
- 沉默YAP通过Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌BGC823细胞的凋亡
- Effect of Yes-associated Protein Knockdown on Apoptosis of Gastric Cancer BGC823 Cells Through Wnt/β-catenin Signaling Pathway
- 肿瘤防治研究, 2018, 45(11): 864-869
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2018, 45(11): 864-869
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2018.18.0495
- 收稿日期: 2018-04-13
- 修回日期: 2018-07-18
引用本文 |
Yes相关蛋白（Yes-associated protein, YAP）参与调控细胞的生长、器官的发育，与肿瘤的发生有关[1]。研究显示，YAP在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤中表达异常，并且其表达水平的高低与肿瘤患者分期及预后等有关[2-3]。在胃癌中发现YAP过度表达，并且与胃癌患者的病理特征等有关[4]。YAP敲低可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，如胰腺癌、乳腺癌等，对于肿瘤细胞的凋亡也具有调控作用[5-6]。Wnt/β-catenin在真核生物体细胞内广泛存在，在正常的成熟细胞中激活水平极低，而在肿瘤细胞中过度激活，与肿瘤细胞的增殖、凋亡等有关[7]。研究表明，YAP可以通过作用于Wnt/β-catenin信号通路影响细胞的生长，提示两者之间存在潜在联系[8]。本实验以BGC823细胞为体外研究对象，通过小RNA干扰技术降低细胞中YAP的表达，明确YAP对胃癌BGC823细胞凋亡的影响及对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。
1 材料与方法 1.1 材料BGC823细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Caspase-3）活性测定试剂盒和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase 9, Caspase-9）活性测定试剂盒为武汉艾美捷公司产品；Lipofectamine2000为美国Invitrogen公司产品；MMLV反转录试剂盒为美国Promega公司产品；qRT-PCR为大连宝生物公司产品；β-连环蛋白（β-catenin）抗体、c-myc抗体、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）抗体、辣根过氧化物标记的二抗均为美国Abcam公司产品；YAP、β-actin引物由上海生工公司合成；YAP siRNA1、YAP siRNA2、siRNA control为美国Santa Cruz Biotech公司产品。YAP siRNA1：5’-GCAUCUUCGACAGUCUUCUTT-3’，5’-AGAAGACUGUCGAAGAUGCTT-3’。YAP siRNA2：5’-GGUGAUACUAUCAACCAAATT-3’，5’-UUUGGUUGAUAGUAUCACCTT-3’。
1.2 细胞分组BGC823细胞中转染YAP siRNA1和YAP siRNA2，同时转染siRNA control，依次命名为si-YAP1、si-YAP2和si-NC，以不作任何处理的BGC823细胞记为Control。细胞转染用Lipofectamine2000，具体步骤参照转染试剂说明书。BGC823细胞培养参数为：饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱。细胞为90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代细胞。细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI1640中。
1.3 qRT-PCR测定转染后细胞YAP mRNA水平Control、si-NC、si-YAP1、si-YAP2细胞培养48 h以后，提取总RNA。用MMLV反转录试剂盒进行反转录，程序为42℃ 65 min；70℃ 5 min；合成的cDNA保存于-80℃。以cDNA为模板，用qRT-PCR扩增。引物序列如下：β-actin F5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3’，β-actin R5’-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’。YAP F5’-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3’，YAP R5’-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3’。结果以2-ΔΔCt法计算。
1.4 蛋白质印迹法测定转染后细胞YAP蛋白水平Control、si-NC、si-YAP1、si-YAP2细胞培养48 h以后，提取细胞中的总蛋白，蛋白保存在-80℃。取蛋白样品，用BCA法对蛋白进行定量。以每个泳道添加40 μg蛋白进行电泳，电泳前将蛋白样品和上样缓冲液以等体积混合煮沸5 min。在浓缩胶中以90 V的低压进行电泳，在分离胶中以120 V的电压电泳，观察染料进入到分离胶的底部之后关闭电源。把蛋白凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，以100 mA电流进行转膜，转膜在4℃进行。转膜结束后把膜放在用TBST稀释的牛血清白蛋白中封闭2 h。取出膜，放入含有YAP一抗（1:200稀释）的平皿中，4℃反应过夜后，再把膜放入含有HRP标记的二抗（1:3 000稀释）中，室温孵育2 h。取出膜，用ECL显色试剂盒显色，凝胶成像仪拍照，分析灰度值，以β-actin为内参。
1.5 MTT法测定细胞增殖Control、si-NC、si-YAP1细胞种植到96孔板中，分别培养24、48、72、96 h以后，用MTT法测定各组胃癌细胞增殖情况。步骤如下：在每孔中添加20 μl的MTT，把细胞放在37℃培养箱内继续培养约4 h，取出培养板，在每个孔中依次添加150 μl的DMSO溶液，置于振荡仪上10 min，放在酶标仪上测定每孔492 nm的A值。每个组设置5个重复孔，测定前以空白孔调零，空白孔中不加细胞。
1.6 平板克隆检测细胞克隆形成能力Control、si-NC、si-YAP1细胞以每个培养皿200个细胞接种到细胞培养皿中，每个培养皿中含有10 ml的培养液。放在37℃、5%CO2培养箱中孵育14 d后，肉眼可以观察到形成的细胞克隆。把培养液吸弃后，用PBS洗涤2次，加入4%的多聚甲醛固定各组细胞15 min。用吉姆萨染色液染约20 min后，用水把染液冲洗掉，放在空气中干燥。计数细胞克隆数目，用（细胞克隆数目÷细胞总数）×100%表示细胞克隆形成率。
1.7 流式细胞术测定细胞凋亡Control、si-NC、si-YAP1细胞分别培养48 h后，用胰蛋白酶消化，收集细胞，用PBS把细胞沉淀洗涤2次。在细胞中添加195 μl的结合缓冲液、5 μl的Annexin V-FITC，混合后再加入10 μl的PI，充分混合，流式细胞仪测定细胞凋亡。
1.8 分光光度法检测Caspase-3、Caspase-9活性Control、si-NC、si-YAP1细胞分别培养48 h后，收集各组细胞，分别用Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒测定细胞中Caspase-3、Caspase-9活性。用酶标仪测定各组样品在405 nm的A值，用实验组A值÷对照组A值表示Caspase-3、Caspase-9活性。同时用蛋白质印迹法测定细胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达，步骤同上，β-catenin、c-myc、cyclinD1、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗分别以1:600稀释。
1.9 Wnt/β-catenin激活剂对敲低YAP后的胃癌细胞增殖和凋亡的影响以20 mmol/L的Wnt/β-catenin激活剂LiCl处理在0 h加入转染YAP siRNA1后的细胞，记为si-YAP1+LiCl。用MTT实验测定si-YAP1+LiCl、si-YAP1细胞48 h的增殖情况，步骤同1.5。平板克隆实验测定克隆形成能力，步骤同1.6。流式细胞术测定48 h细胞凋亡，步骤同1.7。分光光度法检测48 h细胞中Caspase-3、Caspase-9活性，步骤同1.8。蛋白质印迹法测定48 h细胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平，步骤同1.4。
1.10 统计学方法实验数据用SPSS21.0软件统计分析，计量资料以（x±s）表示，多组差异比较用单因素方差，组间比较用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 转染后胃癌细胞中YAP的表达Control、si-NC、si-YAP1、si-YAP2细胞中YAP mRNA水平分别为1.00、（1.01±0.12）、（0.36±0.05）、（0.47±0.03），蛋白水平分别为（0.38±0.04）、（0.39±0.06）、（0.14±0.02）、（0.21±0.04）。si-NC胃癌细胞中的YAP mRNA和蛋白水平与Control比较没有变化。si-YAP1、si-YAP2胃癌细胞中的YAP mRNA和蛋白水平明显低于Control，差异有统计学意义（t1=22.170, P=0.000; t2=30.599, P=0.000; t3=9.295, P=0.000; t4=5.205, P=0.000）。si-YAP1胃癌细胞中的YAP mRNA和蛋白水平明显低于si-YAP2，差异有统计学意义（t1=3.268, P=0.001; t2=2.711, P=0.007），见图 1。YAP siRNA1对胃癌细胞中YAP的转录和表达抑制作用更强，后续选用si-YAP1继续研究。
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| 图 1 蛋白质印迹法测定转染后的胃癌细胞中YAP蛋白水平 Figure 1 YAP protein level in gastric cancer cells after transfection detected by Western blot |
Control、si-NC、si-YAP1细胞24 h的A值分别为0.35±0.04、0.36±0.03、0.24±0.01；48 h的A值分别为0.56±0.06、0.54±0.05、0.28±0.03；72 h的A值分别为0.86±0.09、0.87±0.09、0.31±0.02；96 h的A值分别为0.98±0.07、0.99±0.12、0.35±0.04。克隆形成率分别为（39.62±3.24）%、（38.49±4.51）%、（25.14±2.36）%。si-NC胃癌细胞A值和克隆形成率与Control比较没有变化。si-YAP1胃癌细胞A值和克隆形成率明显低于Control，差异有统计学意义（t1=4.621, P=0.000; t2=7.230, P=0.000; t3=10.333, P=0.000; t4=13.535, P=0.000; t5=6.257, P=0.000）。YAP敲低可以降低胃癌细胞增殖和克隆形成能力，见图 2。
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| *:P < 0.05 图 2 YAP表达下调对细胞生长影响 Figure 2 Effect of down regulation of YAP expression on growth of gastric cancer cells |
Control、si-NC、si-YAP1细胞Caspase-3活性分别为1.00、1.03±0.14、2.61±0.22，Caspase-9活性分别为1.00、0.99±0.11、3.25±0.30，凋亡率分别为（6.32±0.58）%、（6.53±0.71）%、（32.71±2.64）%，Cleaved Caspase-3蛋白水平依次为0.15±0.06、0.16±0.03、0.62±0.05，Cleaved Caspase-9蛋白水平依次为0.52±0.07、0.54±0.09、0.97±0.12。si-NC胃癌细胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9活性与Control比较没有变化。si-YAP1胃癌细胞凋亡率、Caspase-3活性、Caspase-9活性和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平明显高于Control，差异有统计学意义（t1=12.676, P=0.000; t2=12.990, P=0.000; t3=16.911, P=0.000; t4=10.423, P=0.000; t5=5.610, P=0.000），见图 3。YAP敲低可以诱导胃癌细胞凋亡，增加Caspase-3、Caspase-9活性。
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| A: the apoptosis of Control, si-NC, si-YAP1 groups; B: the protein expression of Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 in control, si-NC and si-YAP1 groups 图 3 YAP下调对胃癌细胞凋亡的影响 Figure 3 Effect of down regulation of YAP expression on apoptosis of gastric cancer cells |
Control、si-NC、si-YAP1细胞β-catenin水平分别为（0.32±0.03）、（0.33±0.02）、（0.10±0.01），c-myc水平分别为（0.48±0.05）、（0.49±0.08）、（0.05±0.02），cyclinD1水平分别为（0.66±0.06）、（0.67±0.05）、（0.14±0.06）。si-NC胃癌细胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白水平与Control比较没有变化。si-YAP1胃癌细胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白水平明显低于Control，差异有统计学意义（t1=12.050, P=0.000; t2=13.830, P=0.000; t3=10.615, P=0.000）。YAP敲低可以抑制胃癌细胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路激活，见图 4。
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| 图 4 蛋白质印迹法检测敲低YAP对胃癌细胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白的影响 Figure 4 Effect of YAP knockdown on expression of betacatenin, c-myc and cyclinD1 proteins in gastric cancer cells detected by Western blot |
si-YAP1、si-YAP1+LiCl细胞中β-catenin水平分别为（0.12±0.03）、（0.29±0.05），c-myc水平分别为（0.16±0.03）、（0.54±0.06），cyclinD1水平分别为（0.15±0.04）、（0.71±0.07）。si-YAP1+LiCl胃癌细胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白水平明显高于si-YAP1，差异有统计学意义（t1=5.450; P=0.000, t2=9.812, P=0.000; t3=12.031, P=0.000）。Wnt/β-catenin信号通路激活剂可以促进YAP敲低后的胃癌细胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，见图 5。
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| 图 5 蛋白质印迹法检测Wnt/β-catenin信号通路激活剂对敲低YAP的胃癌细胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白的影响 Figure 5 Effects of Wnt/β-catenin signaling pathway activator on expression of β-catenin, c-myc and cyclinD1 proteins in gastric cancer cells with YAP knockdown detected by Western blot |
si-YAP1、si-YAP1+LiCl细胞A值分别为0.26±0.04、0.34±0.03；克隆形成率分别为（23.51±2.30）%、（31.14±2.69）%；凋亡率分别为（34.26±3.28）%、（15.69±1.27）%；Caspase-3活性分别为1.00、（0.62±0.06），Caspase-9活性分别为1.00、（0.76±0.05），Cleaved Caspase-3水平为（0.53±0.04）、（0.32±0.06）；Cleaved Caspase-9水平为（0.94±0.11）、（0.43±0.05）。si-YAP1+LiCl胃癌细胞A值和克隆形成率明显高于si-YAP1，而细胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9活性、Cleaved Caspase-3水平、Cleaved Caspase-9水平明显低于si-YAP1，差异有统计学意义（t1=2.771, P=0.006, t2=3.734, P=0.000, t3=9.145, P=0.000, t4=10.970, P=0.000, t5=8.314, P=0.000, t6=5.044, P=0.000, t7=7.311, P=0.000），见图 6。Wnt/β-catenin信号通路激活剂可以降低YAP敲低诱导的胃癌细胞凋亡和增殖抑制作用。
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| A: the apoptosis of si-YAP1 and si-YAP1+LiCl; B: the protein expression of cleaved Caspase-3 and cleaved Caspase-9 in si-YAP1 and si-YAP1+LiCl groups 图 6 Wnt/β-catenin信号通路激活剂对敲低YAP的胃癌细胞凋亡影响 Figure 6 Effect of Wnt/ β-catenin signaling pathway activator on apoptosis of gastric cancer cells with YAP knockdown |
人YAP基因定位在11q13染色体上，其编码的蛋白质与转录激活有关，其本身并不能同DNA特异性结合，可以通过与存在于细胞核内的相关因子结合从而影响基因的表达[9]。YAP是Hippo的下游效应分子，其参与调控细胞的生长过程，是一个潜在的癌因子[10]。多西环素可以调控YAP的表达影响小鼠肺癌的发生和发展，而抑制YAP以后，肺癌小鼠肿瘤恶性程度降低[11]。在乳腺癌、胰腺癌、肺癌等患者的癌组织中均检测到YAP的过度表达，并且与患者的预后有关[12-14]。YAP可以调控肿瘤细胞的生长，在视网膜母细胞瘤、卵巢癌等肿瘤细胞中均得到验证[15-16]。YAP在胃癌组织中高表达，并且与胃癌裸鼠成瘤能力有关[17]。本实验结果显示，YAP敲低后的胃癌细胞增殖能力下降，并且克隆形成能力也降低，说明YAP下调后可以发挥抑制胃癌的作用，这与上述研究报道相符合。
本实验结果还显示，YAP下调后的胃癌细胞凋亡增多，并且细胞中Caspase-3、Caspase-9活化水平也升高，YAP敲低诱导Caspase-3、Caspase-9介导的胃癌细胞凋亡。很多研究报道称，YAP不仅参与肿瘤细胞的生长，还与肿瘤细胞凋亡有关[18]。研究显示，在肝癌细胞SMMC-7721中转染YAP shRNA后，细胞的生长速度明显减慢，并且细胞凋亡增多[19]。Caspase级联反应参与肿瘤细胞的凋亡，Caspase-3是该级联反应的执行因子，以酶原的形式存在于正常细胞中，其氮端含有一个前区，可以与Caspase-9等起始因子结合，在受到激活后可以诱导细胞凋亡的发生，细胞凋亡主要分为线粒体途径、死亡受体途径，其中Caspase-9参与线粒体凋亡途径，受到线粒体内相关信号刺激以后，可以活化形成Cleaved Caspase-9，从而激活Caspase级联反应，诱导凋亡发生[20]。
Wnt/β-catenin是经典的Wnt信号通路的分支，在正常情况下，β-catenin可以由多个蛋白酶形成的泛素化蛋白酶体介导而处于降解状态，使得细胞内维持低水平的β-catenin，当细胞受到相关信号刺激以后，导致细胞内的β-catenin降解受阻，β-catenin大量聚集以后转移至细胞核内，影响下游基因的转录，调控细胞的生长[21-22]。Wnt/β-catenin与多种疾病的发生有关，在糖尿病心肌病、缺血再灌注、哮喘、肺炎等疾病中均有重要作用[23-24]。研究显示，Wnt/β-catenin在肿瘤中过度激活，其下游靶基因c-myc、cyclinD1转录和表达水平升高，是肿瘤细胞过度增殖和凋亡减少的重要原因[25]。YAP与Wnt/β-catenin共同作用影响胚胎的发育，组织器官的形成，在胶质瘤中发现，YAP可以影响胶质瘤细胞中Wnt/β-catenin的激活影响肿瘤细胞的生长[26-27]。本研究表明，YAP下调可以降低Wnt/β-catenin信号通路的激活水平，减少下游靶基因c-myc、cyclinD1的表达，而用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理后，YAP下调对胃癌细胞增殖凋亡的影响减弱，说明YAP可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活再通过线粒体途径调控胃癌细胞的凋亡。
综上，YAP下调后可以诱导胃癌细胞的生长并促进胃癌细胞凋亡，并且其作用机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。YAP是潜在的治疗胃癌的基因靶点，沉默其表达后可以发挥抗肿瘤的作用，这为以后靶向YAP治疗胃癌提供了有力依据。本实验只在一株胃癌细胞系中进行了初步探讨，以后会在多株胃癌细胞和动物实验中进行验证，为明确YAP在胃癌中的作用提供可靠依据。
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