0 引言

卵巢癌发病率居妇科恶性肿瘤第三位，但死亡率居妇科恶性肿瘤之首^[1]。因其早期症状隐匿，缺乏有效的筛查手段，超过70%的患者就诊时已为晚期。目前，手术+铂类/紫杉醇联合化疗仍然是卵巢癌患者的主要治疗手段，但其复发率超过了85%。复发性卵巢癌耐药性明显增加，使用化疗药物缓解率不足30%，且化疗药物的不良反应限制了其使用剂量^[2]，因此，单纯依靠现有技术提高患者的生存率非常有限，需要探索更加有效的治疗方法。成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor, FGFs）于大脑和垂体的组织提取物中首次发现，迄今在哺乳动物体内已经鉴别出22种^[3]。FGF信号通路具有多种生物学功能，如参与胚胎发育、器官形成、损伤组织修复、血管生成，促进细胞分化、生存、增殖、迁移及侵袭等。异常的FGF信号可以通过促进肿瘤增殖、生存、抑制肿瘤凋亡、促进肿瘤细胞迁移、侵袭等多种途径参与肿瘤的发生发展^[4]。近年来，大量研究发现在多种类型癌症中存在FGF3和FGF10的过表达，并且证实FGF3和FGF10参与肿瘤的发生发展^[5-6]。而FGF3和FGF10在卵巢癌中研究甚少，因此本研究选取FGF3和FGF10作为研究的靶点，探讨其与卵巢癌的关系。鉴于文献报道癌症中激活的Wnt/β-catenin信号通路可以引起FGF信号通路的激活，且FGF20、FGF9等多个FGFs被证实是Wnt信号通路的靶基因^[7-8]，故本研究还探讨Wnt/β-catenin信号通路与FGF3、FGF10的相互关系，试图筛选出对卵巢癌的复发和预后有预测作用的指标，为卵巢癌的靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 细胞和主要试剂

卵巢癌细胞株SKOV3由西安交通大学第一附属医院转化医学中心提供，小干扰RNA购自上海吉玛公司，RPMI 1640购自美国Gibco公司，胰蛋白酶购自美国Sigma公司，新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，FGF3/10多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，GAPDH单克隆抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

人卵巢癌细胞株SKOV3常规培养在含100 ml/L小牛血清的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃、5%CO₂饱和湿度，待细胞长满瓶底时，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。当细胞达到对数生长期时，进行实验。

1.3 FGF3/10 siRNA的构建与转染

siRNA表达载体由上海吉玛生物有限公司合成，FGF3 siRNA两条：分别为siRNA-858序列：5’-GCUGGGCUAUAAUACGUAUTT-3’；siRNA-706序列：5’-CCUACAGUAUUUUGGAGAUTT-3’。FGF10 siRNA两条：分别为siRNA-230序列：5’-CGCUGGAGAAAGCUAUUCUTT-3’；siRNA-410序列：5’-GGGAAACUCUAUGGCUCAATT-3’。阴性对照（siRNA-NC）序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。严格按照Lipofectamine^TM2000试剂说明书进行转染。将培养至对数生长期的细胞以3×10⁵个/孔接种于六孔板，细胞过夜贴壁，使其生长至50%左右的融合度。转染当天换为2 ml无血清培养基。100 μl无血清培养基中分别加入15 μl siRNA和7 μl Lipofectamine^TM 2000，室温静置5 min后混合，室温静置20 min。将上述混合物加入六孔板中，轻轻混匀，继续培养48 h或72 h。荧光显微镜下观察转染效率。转染效率达70%为转染成功，可进行下一步实验。

1.4 Real-time PCR检测mRNA表达

Trizol法提取细胞总RNA, 测定RNA浓度与纯度，按试剂盒说明书将mRNA反转录为cDNA。在ABI7300荧光定量PCR仪上进行检测。反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环，用2^-ΔΔCt法^[5]计算基因相对表达水平。实验重复3次。

1.5 Western blot检测蛋白表达

裂解提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白质定量试剂盒测定总蛋白浓度，煮沸5 min使蛋白变性，12%的SDS-PAGE电泳分离后，湿转到硝酸纤维素膜上，将膜置于50 g/L脱脂奶粉中室温封闭1h，再以含5%脱脂奶粉的TBST稀释的一抗（GAPDH：1:1 000；FGF3：1:200；FGF10：1:200）封闭NC膜，4℃过夜。TBST洗膜8 min×5次，再与辣根酶标记的羊抗鼠二抗按1:2 000室温孵育2 h，TBST洗膜后，ECL显色，使用Image-Lab软件进行成像扫描记录。蛋白表达以光密度表示，以目的蛋白/GAPDH比值来表示蛋白的相对表达量, Image-Lab软件对结果进行分析并拍照。

1.6 Transwell法检测细胞迁移

将Millicell小室放入24孔板内，向每个小室中加入200 μl不含血清的细胞悬液，使细胞数达到3×10⁵个/小室；向Millicell小室下室中加入600 μl含20%胎牛血清的RPMI1640培养基；37℃、5%CO₂培养箱中培养48 h后，取出细胞，用镊子夹出小室，移至另一含有600 μl 1×PBS的孔内浸泡3 min，取出小室，用棉签小心擦去微孔膜上层细胞。如此洗涤3次。再将小室放入70%甲醇中室温固定30 min，同上用1×PBS洗涤三遍；将小室移入含600 μl 0.1%结晶紫的孔内，室温染色30 min；用棉签擦拭小室内侧，室温晾干；在10倍视野下，随机选取5个视野，显微镜下计数穿膜细胞数，取其平均值，实验重复三次。

1.7 Transwell法检测细胞侵袭

Transwell小室中加入以无血清RPMI1640培养基稀释的Matrigel，37℃静置4~6 h，待胶凝固，向每个小室中加入200 μl不含血清的细胞悬液，使细胞数达到3×10⁵个/小室；向Millicell小室下室中加入600 μl含20%胎牛血清的RPMI1640培养基；37℃、5%CO₂培养箱中培养48 h后，取出细胞，用镊子夹出小室，移至另一含有600 μl 1×PBS的孔内浸泡3 min，取出小室，用棉签小心擦去微孔膜上层细胞。如此洗涤3次。再将小室放入70%甲醇中室温固定30 min，同上用1×PBS洗涤三遍；将小室移入含600 μl 0.1%结晶紫的孔内，室温染色30 min；用棉签擦拭小室内侧，室温晾干小室；显微镜照相并计数：计数穿过微孔的细胞数，在10倍视野下，随机选取5个视野，显微镜下计数穿膜细胞数，取其平均值，实验重复三次。

1.8 统计学方法

实验数据用SPSS18.0统计软件进行统计分析，计量资料结果用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析和t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 siRNA转染SKOV3细胞效率的检测结果

由于siRNA NC带有FAM基因，在荧光显微镜下，可以观察到转染成功的SKOV3细胞表达绿色荧光。转染SKOV3细胞48 h时，在荧光显微镜下观察转染效率，比较一个视野内荧光细胞数与细胞总数的比例。结果显示SKOV3细胞的转染效率达70%以上，可用于后续实验，见图 1。

2.2 特异性FGF3 siRNA和FGF10 siRNA对SKOV3细胞FGF3 mRNA和FGF10 mRNA表达的抑制作用

为了明确FGF3 siRNA和FGF10 siRNA转染效果，利用Real-time PCR法检测siRNA对SKOV3细胞中FGF3 mRNA和FGF10 mRNA的抑制作用。通过与GAPDH的Ct值差异来均衡各实验组之间的差异，应用2^-ΔΔCt方法进行分析，结果发现，与siNC组相比，转染了FGF3 siRNA-858、siRNA-706的mRNA分别下降了91.9%（P=0.003）、92.3%（P=0.003)，差异具有统计学意义，见图 2；转染了FGF10 siRNA-230、siRNA-410的mRNA分别下降了84.2%（P=0.006）、92.2%（P=0.003），差异具有统计学意义，见图 3。说明小干扰后，FGF3和FGF10 mRNA表达显著降低。

2.3 特异性FGF3 siRNA和FGF10 siRNA对SKOV3细胞FGF3蛋白和FGF10蛋白表达的抑制作用

应用Western blot法检测FGF3 siRNA和FGF10 siRNA对FGF3和FGF10蛋白水平的作用。FGF3 siRNA-858和FGF siRNA-706均能显著抑制FGF3蛋白水平（P=0.007; P=0.004），FGF10 siRNA-230和FGF siRNA-410也能显著抑制FGF10蛋白表达（P=0.006; P=0.005），差异均具有统计学意义；而NC组与未处理SKOV3细胞中的FGF3和FGF10蛋白表达比较，差异无统计学意义（均P > 0.05），见图 4。依据siRNA对FGF3、FGF10 mRNA和蛋白的抑制水平，我们选择抑制水平最高的siRNA-706和siRNA-410用于后续实验。

2.4 特异性FGF3 siRNA和FGF10 siRNA对SKOV3细胞迁移及侵袭能力的影响

为了明确FGF3和FGF10与卵巢癌侵袭转移的关系，我们采用Transwell小室法检测干扰FGF3和FGF10基因前后SKOV3细胞的迁移及侵袭能力的变化。采用不铺基质胶及铺基质胶的Transwell小室，模拟肿瘤在体内迁移及侵袭的过程，用穿过膜的细胞数反映SKOV3细胞的体外迁移及侵袭能力。

结果显示，转染了FGF3 siRNA-706和FGF10 siRNA-410的SKOV3细胞与NC组及未处理组相比，通过未铺胶的Transwell小室的细胞数目与NC组相比明显减少，差异具有统计学意义（P=0.000; P=0.008），见图 5。通过铺胶的transwell小室的细胞数目与NC组相比明显减少，差异具有统计学意义（P=0.000; P=0.009），见图 6。

2.5 激活Wnt/β-catenin通路后对FGF3 mRNA和FGF10 mRNA水平的影响

使用Wnt通路激活剂LiCl激活Wnt通路，然后采用Real-Time PCR法检测Wnt通路激活后，FGF3 mRNA和FGF10 mRNA水平的变化。结果显示，10 mmol/L LiCl处理组和未处理组相比，FGF3 mRNA和FGF10 mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义（P=0.006）；20 mmol/L LiCl处理组和未处理组相比，FGF3 mRNA和FGF10 mRNA水平显著增加，差异也具有统计学意义（P=0.038），见图 7。

3 讨论

卵巢癌组织来源复杂，包含了多种组织病理类型，上皮性卵巢癌占全部卵巢癌的80%。卵巢癌发病率虽然低于宫颈癌，但其死亡率却居妇科恶性肿瘤的首位。卵巢癌容易发生局部侵袭和远处转移，这也是卵巢癌患者预后差、死亡率高的主要原因^[1]。

FGF3和FGF10是FGFs家族的成员，已有研究证明，原癌基因FGF3在多种肿瘤如膀胱癌^[9]、口腔癌^[10]、肝癌^[11]、乳腺癌^[12]、肺癌^[9]中均呈高表达。FGF10是众所周知的乳腺癌致癌基因，在大约10%的乳腺癌中存在扩增^[13]。Matsuike等运用PCR和Western blot法在结直肠癌细胞株中检测到了FGF10 mRNA的扩增和FGF10蛋白的表达^[14]。本研究运用RNA干扰来探讨FGF3和FGF10在卵巢癌转移中的作用及其机制。

本研究首先利用GeneBank检索相关序列，针对FGF3和FGF10设计了两条靶序列及一条无义序列（NC）作为对照，无义序列带有FAM荧光报告基团，可以在荧光显微镜下发出荧光。通过荧光显微镜观察细胞所发出的荧光，可以判断siRNA瞬转的效率，优化转染条件。采用siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞，荧光显微镜下观察转染效率，利用Real-Time PCR法和Western blot法分别检测特异性FGF3 siRNA和FGF10 siRNA对FGF3和FGF10 mRNA和蛋白表达的抑制效果。结果显示，与siNC相比，FGF3 siRNA-706和FGF10 siRNA-410可以明显抑制FGF3和FGF10的mRNA水平和蛋白的表达。因此，后续实验采用FGF3 siRNA-706和FGF10 siRNA-410进一步研究对SKOV3细胞功能的影响。

为进一步研究FGF3和FGF10在卵巢癌转移中的作用，本研究进行了Transwell实验。结果表明干扰FGF3基因后可以明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的迁移和侵袭。这与张孝卫等用RNA干扰大肠癌HT-29细胞的FGF3基因后细胞的迁移能力明显下降^[15]的结论相一致。也与蒋林芳等通过免疫组织化学实验得出FGF3的蛋白表达和卵巢癌的FIGO分期有显著的相关性这一结论相一致^[16]。通过Transwell实验，本研究同样发现干扰FGF10基因可以明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的迁移和侵袭，这与Abolhassani等报道的用siRNA干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞中FGF10可以抑制乳腺癌的迁移^[17]，Itoh等报道FGF10可以促进胰腺癌细胞株的侵袭^[18]的结论一致。

FGF3和FGF10影响细胞增殖和迁移的特异机制目前尚不明确。Wnt/β-catenin通路的活化在许多人类肿瘤中被发现，而且其靶基因的激活可以通过影响细胞迁移、增殖和血管生成等促进肿瘤的发展。本研究通过Real-Time PCR技术检测了激活Wnt/β-catenin通路后FGF3和FGF10 mRNA水平的变化。结果显示使用10 mmol/L LiCl处理SKOV3细胞后可以明显提高FGF3和FGF10 mRNA的水平，且效果最强。使用20 mmol/L LiCl处理SKOV3细胞后也可以提高FGF3和FGF10 mRNA的水平，但其mRNA上升水平低于10 mmol/L LiCl。推测可能是因为20 mmol/L LiCl对SKOV3细胞产生了细胞毒性，导致细胞死亡，影响细胞中FGF3和FGF10 mRNA的水平。这个结果说明激活Wnt/β-catenin通路可以明显提高FGF3和FGF10的mRNA水平。这与Aman等在胚胎发育研究中抑制Wnt/β-catenin信号通路后会引起FGF3和FGF10表达下调的结论一致^[19]。

综上所述，FGF3和FGF10的表达与卵巢癌细胞迁移能力和侵袭能力密切相关，FGF3和FGF10受Wnt/β-catenin信号通路的调控来促进卵巢癌SKOV3细胞的转移。本研究结果证明FGF3和FGF10在卵巢癌转移中起重要作用，FGF3和FGF10有可能成为卵巢癌患者基因治疗的有效靶点。