0 引言

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，2017年肺癌新发病例222 500（其男性116 990，女性105 510），死亡病例155 870（其中男性84 590，女性71 280），已成为肿瘤相关死亡率最高的恶性肿瘤^[1]。肺癌最主要的病理类型为腺癌、鳞癌和小细胞癌^[2]。随着二代测序技术的发展，对肺癌基因组及转录组变异特征的研究取得了不少进展。然而目前尚缺乏对肺癌发生发展过程多组学分子机制的研究。本文将综述近年来肺癌分子生物学研究的重要成果，描述其基因组及转录组的特征，并阐述肺癌的起源及肿瘤内部异质性，希望为后续肺癌发生发展过程多基因组学的研究提供方向及依据。

1 基因组变异 1.1 吸烟的影响

吸烟在肺癌的发生、发展中起着重要的作用^[3]。与吸烟相关的肺癌是少数有较高突变负荷的肿瘤之一^[4]。在肺腺癌中吸烟者发生C→A颠换的频率高于非吸烟者^[5]。无论哪种病理类型的吸烟肺癌患者的平均体细胞突变率都约为（8~10）/Mb，远高于非吸烟肺癌患者^[6-8]。非吸烟肺腺癌患者的平均体细胞突变率约为（0.8~1）/Mb^[5]。Kawaguchi等研究发现随着吸烟剂量的增加P53及KRAS相对突变率增加，而EGFR和SMAD4突变率下降^[9]。一项基于30例亚洲肺癌患者的全基因组测序发现吸烟者与非吸烟者的突变机制类似，因此表明亚洲非吸烟肺癌的高发病率不太可能是由于二手烟或者其他导致氧化性DNA损伤的致癌物所致^[10]。除此之外，吸烟还会使肺癌的表观遗传发生改变^[11-12]。一般来说，单一突变并不足以引起癌变，但当长期吸烟时人支气管上皮细胞发生表观遗传的改变，此时单一的关键原癌基因如KRAS的突变就可使正常细胞癌变，进而发展为腺鳞癌^[13]。但是吸烟导致的细胞癌变到整个肿瘤形成的过程并不清楚。

1.2 染色质和基因拷贝数变异

染色体部分结构的缺失或重排等，可能造成某些基因拷贝数的变异，如原癌基因的扩增或抑癌基因的缺失。通过对肺癌患者肿瘤拷贝数的分析发现有些变异是不同病理类型的肺癌所共有的，而有些变异常见于某些特定的病理类型^[14]。含有许多抑癌基因的3号染色体短臂的缺失常见于各种病理类型的肺癌^{[5, 7-8]}。3号染色体长臂上SOX2的选择性扩增常见于肺鳞癌和小细胞肺癌。14号染色体长臂上NKX2-1的选择性扩增常发生于肺腺癌。肺腺癌中最常见的扩增为5号染色体短臂TERT的扩增^[15]。各种病理类型肺癌常见的原癌基因扩增和抑癌基因的缺失见表 1。一项基于660例肺腺癌组织和484例肺鳞癌组织基因拷贝数的分析发现了一些新的扩增基因，肺腺癌特异的MIR21，肺鳞癌特异的MIR205和两者共有的MAPK1^[16]。然而目前很少有研究直接证明这些肿瘤相关基因拷贝数变异对细胞增殖及迁移等功能的影响。

1.3 基因突变

随着高通量二代测序技术的发展，现在我们已经能精确的识别编码序列单碱基的改变。目前有很多公共的大样本癌症基因组资料，如癌症基因图谱（TCGA）和国际癌症基因组联盟（ICGC）。我们通过cBioPortal（www.cbioportal.org）^[17-18]分析整理了目前肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌常见的突变基因，见表 1。

肺腺癌中最常见的原癌基因突变为KRAS（29%）。抑癌基因突变在肺腺癌中最常见的为TP53，突变率为51%。SMARCA4是染色质修饰基因，其突变率为10%。RNA剪接基因RBM突变的发生率为8%，U2AF1为2.4%。随着更多大样本研究的开展，一些新的腺癌驱动基因被发现。如一项对101例肺腺癌的研究发现了两个新的驱动基因POU4F2（突变率为8.9%）和ZKSCAN1（突变率为5.9%）^[19]。

虽然肺鳞癌中的很多突变与腺癌类似，如TP53和CDKN2A（突变频率分别为81%和14%），但是其频发突变与其他鳞癌更相似，如头颈部鳞癌和膀胱癌^[16]。Paik等研究发现PI3K异常的Ⅳ期鳞癌患者预后更差，有更高的转移负荷，且更容易发生脑部转移^[20]。

在小细胞肺癌中抑癌基因TP53和RB1的失活普遍存在，这表明这两个抑癌基因的失活是形成小细胞肺癌所必须的^[8]。TMEM132D、SPTA1和VPS13B突变普遍存在于在早期和晚期、原发和转移以及化疗前后的小细胞肺癌中^[21]。Rudin等研究表明小细胞肺癌中G→T颠换最常见，其次是G→A和A→G的颠换^[22]。约四分之一的小细胞肺癌都有NOTCH家族的失活突变^[23]。

1.4 表观遗传变异

表观遗传指所有不通过DNA序列改变就能影响基因表达，从而决定细胞乃至个体表型的、可体细胞遗传的调控方式，包括DNA甲基化、组蛋白修饰等。通过表观遗传的调节可以使肿瘤原癌基因高表达、抑癌基因沉默^[24]。肿瘤中CpG岛高甲基化与MYC的高表达相关^[15]。影响组蛋白乙酰转移酶相关基因，如：CREBBP和EP300基因的突变在小细胞肺癌中较常见^[25]。在体内和体外实验中，NatD都可促进肺癌细胞的迁移和侵袭能力^[26]。一项基于非小细胞肺癌小鼠模型的研究发现，通过增加肿瘤浸润性CD8+淋巴细胞和下调MYC信号，联合DNA甲基化转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂能抑制肿瘤生长，这有望成为新的治疗肺癌的方法^[27]。

2 转录组的改变

除了基因编码序列本身的改变会影响其表达外，RNA的转录和剪接等也对基因表达的调控起着重要的作用。通过外显子测序和转录组数据的联合分析发现，肺癌的发生与影响RNA转录的DNA序列的改变、剪接位点的变异和基因的融合有着密切的关系^[5-7]。Liu等通过对剪接位点的研究发现，106个剪接位点突变与肿瘤特异性异常剪接相关，包括一些已知肿瘤相关基因的突变，如RB1、EP300、ABL1、AKT3等^[28]。MET内含子的突变使其发生外显子14跳跃导致MET表达缺失从而促进肿瘤生长^{[5, 29]}。约3%的肺癌患者有U2AF1突变，该突变使很多基因发生不适当的选择性剪接，如原癌基因CTNNB1，从而使其活化。

融合基因在肺癌的发生中发挥着重要的作用，且很多融合基因已经成为肺癌治疗的靶点，如EML4-ALK。约3%~8%的肺腺癌患者有ALK基因的重排，克唑替尼对这类患者一定的疗效，而艾乐替尼的疗效最佳^[30-32]。约3%的肺癌患者有NTRK1基因融合，MPRIP-NTRK1和CD74-NTRK1融合都可导致TRKA激酶活性增强从而致癌^[33]。在无KRAS突变的肺腺癌患者中NRG1融合的发生率为17.6%，CD74-NRG1融合可激活HER2HER3信号^[34-35]。在小细胞肺癌中RB1重排发生率为13%，其次是TP7为37%^[23]。在肺鳞癌中可发生FGFR基因重排，但较为罕见^[36]。随着转录组研究技术的发展，越来越多新的肿瘤相关融合基因被发现，这将为未来肺癌的精准治疗提供更多的靶点。

3 信号通路变异

通过对肺癌全外显子和转录组测序的联合分析，发现了许多肺癌相关的信号通路。我们通过cBioPortal（https://www.cbioportal.org）分析整理了P53、细胞周期调控、NOTCH、RTK/PI3K-MTOR四种信号通路的改变在肺腺癌、肺鳞癌和非小细胞肺癌中所占比例，见表 1。在肺腺癌中RTK-RAS-RAF信号通路变异最常见，占76%^[5]。其次是P53信号通路，占61%。除了表中所列的四种信号通路，NFE2L2/KEAP1信号通路改变（占34%）、鳞状分化基因（占44%）在肺鳞癌的发生发展中也发挥着重要的作用^[7]。在小细胞肺癌中，P53、细胞周期调控和NOTCH信号通路的改变是非常常见的，而在罕见的肺神经内分泌肿瘤肺类癌中却很少见TP53和RB1的变异，这表明肺类癌并不是高度侵袭性肺内分泌肿瘤的早期阶段^[37]。对肺癌关键信号通路的研究有助于我们寻找新的治疗靶点，并发现其耐药机制，从而改善肺癌患者的预后。

4 细胞起源

肺泡上皮是由前肠内胚层前腹侧的原始肺泡芽发育而来。组成肺泡上皮的细胞类型及每种细胞所占的比例由近端气道到远端气道不断变化。近端气道主要有基底细胞、柱状细胞、纤毛细胞、神经内分泌细胞和杯状细胞，而远端肺泡主要是由Ⅰ型和Ⅱ型肺泡细胞组成。在胚胎的发育过程中Ⅰ型和Ⅱ型肺泡细胞直接由前体细胞发育而来，出生以后Ⅰ型肺泡细胞的损伤可刺激成熟的Ⅱ型肺泡细胞分化产生新的Ⅰ型肺泡细胞^[38]。EGFR、KRAS和TGF-β蛋白的活化可使成熟的Ⅱ型肺泡细胞具有干细胞功能^[39]。基于小鼠的研究发现肺腺癌可起源于Ⅱ型肺泡上皮细胞、连接细胞和支气管肺泡导管的柱状细胞，这些细胞KRAS的活化导致了腺癌的发生^[40-41]。一项基于小鼠的研究发现气管支气管基底细胞SOX2基因的过表达和CDKN2AB及PTEN基因缺失可导致肺鳞癌的发生^[42]。Weeden等发现人肺基底细胞的表达谱与肺鳞癌细胞密切相关，而与其他类型肺癌不相关。且肺鳞癌细胞表达谱只与肺基底细胞相关而与其他类型肺上皮细胞不相关，从而推测肺鳞癌起源于肺基底细胞^[43]。由于小细胞肺癌多发生在周围气道且表达神经内分泌标志物，因此一直被认为起源于肺神经内分泌细胞。Sutherland等小鼠模型研究发现TP53和RB1缺失的肺神经内分泌细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞均可发展为小细胞肺癌^[44]。这些研究都是基于小鼠模型，然而在人体内一个细胞的变异如何发展为一个肿瘤并不清楚。

5 克隆进化与肿瘤内部异质性

肺癌的发生是单克隆起源的，而在其进化的过程中又会获得许多不同的亚克隆。肿瘤由大量的细胞构成，而这些细胞具有不同的分子和表型特征，从而导致了肿瘤的内部异质性的存在^[45]。一项对100例早期非小细胞肺癌的327个肿瘤区域的研究发现，平均每个肿瘤存在30%体细胞突变亚克隆和48%拷贝数异常亚克隆，肿瘤的分期与亚克隆拷贝数异常的比例呈正相关，且高拷贝数异质性与肿瘤的复发和死亡风险增加相关^[46]。EGFR，MET，BRAF和TP53突变多是初始的克隆，而在之后的肿瘤进化中超过75%的肿瘤会获得亚克隆，最常见的为PIK3CA和NF1的突变。基因组加倍和染色体的不稳定性可产生拷贝数变异异质性，包括CDK4、FOXA1和BCL11A扩增，也可通过丢失克隆突变的基因组片段而直接导致突变的异质性。在小细胞肺癌进化过程中NOTCH信号通路的激活可导致肿瘤异质性的产生^[47]。肿瘤的内部异质性是导致其治疗失败和药物耐药的一个重要原因^[48]。通过对肿瘤进化和内部异质性的研究，我们能进一步了解肿瘤发生发展的全过程，找到肿瘤进化的限制因素，从而更加主动地治疗肿瘤。

6 结论

肺癌的发生与发展是由基因突变、拷贝数变异、转录组调节和表观遗传调节等多个方面共同调控的，并与吸烟密切相关。随着近年来高通量二代测序技术的发展，促进了对肺癌分子生物学的研究，然而目前尚缺乏对肺癌发生发展过程的多组学分子机制的研究。未来需要更多的研究来阐明肺癌从单克隆起源演化为具有侵袭性肿瘤的整个过程的分子机制，从而有助于我们寻找更为主动的肺癌治疗方法，阻止肿瘤的发生或在早期阶段阻止肿瘤的发展。