0 引言

肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）是目前世界范围内严重威胁人类生命健康的泌尿生殖系统肿瘤之一，发病率为0.1‰，占全身所有癌症的2%~3%^[1-2]。近年来，世界各地肾细胞癌的发病率和死亡率都在逐年上升^[3]。因此，寻找新型敏感可靠的分子标志物帮助预测肾细胞癌的早期治疗和早期转移尤为重要。

RNA基因组学的快速发展突出显示了长链非编码RNA（lncRNA）在调控人类肿瘤中的作用^[4]。长链非编码RNA是一种长度大于200个核苷酸的RNA分子，不能转录翻译成为蛋白质，而且一度认为其在生物体内没有实质性的作用^[5-6]。前列腺癌中转移相关的肺腺癌转录物1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT-1）的升高与Gleason评分、前列腺特异性抗原表达及肿瘤分期相关，而MALAT-1的下调可一定程度上抑制前列腺癌细胞生长、侵袭和迁移^[7-10]。根据研究显示，c-Myc在高达70%的人类恶性肿瘤中表达上调^[11-12]。虽然关于c-Myc蛋白在肿瘤发展中的代谢调节作用已被广泛研究，但是和相关长链非编码RNA共同的潜在作用和机制仍是未知。

本研究分析了FILNC1及其相关性c-Myc在肾细胞癌组织和细胞中的表达，为探讨肾细胞癌的发生发展过程提供一定的理论基础。

1 材料与方法 1.1 细胞培养和临床标本

人肾细胞癌细胞株OS-RC-2、G401、A498、Caki-1和ACHN细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。FILNC1-siRNA和阴性对照（NC）购自中国上海GenePharma生物有限公司。脂质体Lipofectamine 2000、miR-200a-inhibitor和NC组模拟物购自上海吉凯基因生物技术公司，TRIzol购自美国Ambion公司，反转录试剂盒（FSQ-101）购自日本Toyobo公司，PCR试剂盒购自美国Kapa公司。荧光素酶活性检测试剂盒购自Promega公司，荧光素酶报告载体由美国Promega公司合成。

1.2 定量实时PCR分析

将细胞接种在12孔板中，生长至50%融合以进行siRNA转染，90%用于质粒转染。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000转染质粒和siRNA。在转染后第3天，收获细胞，并使用TRIzol试剂提取总RNA。使用ImProm-Ⅱ TM反转录系统对总RNA水平进行qPCR分析。所有反应用Step-One Plus实时PCR系统进行，实验重复3次。

1.3 MTT测定细胞增殖

将肾细胞癌A498细胞以5×10⁴个每孔的密度接种到6孔板中，中间每隔2天更换新鲜培养液，每隔1天加入20 μl MTT测定液，每孔充分混合均匀，并在37℃下孵育4~6 h。使用无菌吸管吸出上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜（DMSO），在室温下搅拌10 min保证晶体充分溶解。每隔1天进行MTT测定波长为490 nm时的吸光度，计算FTC-133细胞的增殖情况，实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测肾细胞癌细胞凋亡

将肾细胞癌A498细胞以每孔2×10⁵个的密度接种在6孔板中，分别用NC和FILNC1-siRNA转染，转染72 h后，通过FITC标记的AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞，实验重复3次。

1.5 荧光素酶报告基因测定

从人基因组DNA扩增FILNC1启动子序列，随后插入萤光素酶报道载体pGL3增强子，命名为pGL3-FILNC1，将报道质粒Hotair和对照载体共转染到293T细胞中，培养28 h后，将293T细胞在裂解缓冲液中裂解，通过荧光素酶测定系统测量野生型c-Myc-3’UTR和突变型c-Myc-3’UTR的荧光素酶活性的变化，将其归一化至裂解物蛋白质浓度并计算其相对值，实验重复3次。

1.6 蛋白质印迹测定

使用RIPA缓冲液提取总细胞裂解物，通过配置12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并转移到PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭，并于4℃与一抗（浓度1:1 000）一起孵育过夜。随后，将膜与二抗孵育，最后用ECL底物试剂盒检测，实验重复3次。

1.7 裸鼠肿瘤异种移植模型

将1×10⁶密度的NC组和FILNC1-siRNA组A498细胞分别注射到4周龄裸鼠的腋窝处。饲养8周后检测裸鼠肿瘤异种移植物的体积和质量生长情况。异体移植物大小根据以下公式测量：体积= 1/2（a）²×（b）。

1.8 统计学方法

采用SPSS22.0软件，计量数据以（x±s）表示，两组间均数比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 FILNC1在肾癌组织和细胞株中的表达情况

qPCR结果表明，与癌旁正常组织相比，肾细胞癌组织中FILNC1 mRNA表达水平明显较高（（1.18±0.19）vs.（0.16±0.08），P=0.025）；FILNC1在肾细胞癌A498细胞株中表达水平比其他细胞株（OS-RC-2, G401, Caki-1, ACHN）明显增高（（0.92±0.14）vs.（0.25±0.02）vs.（0.75±0.08）vs.（0.38±0.05）vs.（0.19±0.02），P=0.024）），见图 1。由此推测FILNC1在肾细胞癌中可能扮演起促癌作用，挑选A498为进一步生物学功能实验的细胞株。

2.2 双荧光素酶实验检测FILNC1和c-Myc之间的关系

通过生物信息学预测网站筛选与FILNC1有直接作用的蛋白分子，c-Myc的3’UTR与FILNC1具有相似的结合位点，见图 2A。进一步通过双荧光素酶验证FILNC1与c-Myc的3’UTR结合调控情况，将FILNC1与c-Myc共转染到293T细胞中，双荧光素酶报告基因结果显示：FILNC1可以明显抑制野生型c-Myc的荧光素酶活性（P=0.018），但不能调控突变型c-Myc的活性，见图 2B。表明FILNC1能与3’UTR特异性结合，且可调控c-Myc的表达活性。

2.3 Western blot检测FILNC1对c-Myc表达的影响

在FILNC1-mimic组中c-Myc的表达水平比NC组明显升高（（86.32±12.35）% vs.（25.62±6.85）%，P=0.016），而FILNC-inhibitor组c-Myc的表达水平降低（（5.95±1.15）% vs.（25.62±6.85）%，P=0.018）。过表达FILNC1后，c-Myc蛋白的表达相应上调，抑制FILNC后，c-Myc蛋白的表达相应下调，表明FILNC1的表达可以直接影响c-Myc蛋白表达，见图 3。

2.4 FILNC1对肾癌细胞增殖和凋亡行为的影响

CCK-8结果显示，FILNC1-inhibitor实验组的细胞增殖率明显低于NC对照组（6天）（（0.78±0.09）vs.（0.12±0.06），P=0.028）。细胞凋亡实验显示，FILNC1-inhibitor实验组的细胞凋亡率明显高于NC对照组（（2.28±0.27）vs.（0.75±0.18），P=0.016），表明抑制FILNC1的表达后，肾细胞癌A498细胞的增殖能力受到一定抑制，而细胞的凋亡行为相应增强，见图 4。

2.5 c-Myc对肾癌细胞增殖和凋亡行为的影响

CCK-8结果显示，c-Myc-inhibitor实验组的细胞增殖率明显低于NC对照组（6天）（（1.62±0.25）vs.（0.16±0.08），P=0.016）。细胞凋亡实验显示，c-Myc-inhibitor实验组的细胞凋亡率明显高于NC对照组（（2.31±0.22）vs.（0.52±0.11），P=0.026），表明抑制c-Myc的表达后，肾细胞癌A498细胞的增殖能力受到一定的抑制，而细胞的凋亡行为相应增强，见图 5。

2.6 FILNC1对肾癌细胞裸鼠成瘤能力的影响

与NC组裸鼠肿瘤体积和重量相比，FILNC1-inhibitor组的肿瘤体积明显缩小（（3.24±0.32）cm³ vs.（0.42±0.17）cm³，P=0.034），重量减轻（（4.04±0.52）g vs.（0.49±0.31）g，P=0.041）。表明抑制FILNC1的表达后，可以有效抑制肾细胞癌在裸鼠体内的瘤体生长。免疫组织化学法检测Ki67相关蛋白的表达，其在裸鼠移植瘤内的表达相比NC组减少，表明FILNC可以抑制肾癌细胞的增殖能力，见图 6。

3 讨论

新一代基因测序技术已经证实人类基因组包含许多未被认知长链非编码RNA，尽管现在已经发现了数千种lncRNA，但到目前为止，只有非常少量lncRNA可以直接具有表达作用^[13]。已有研究证明，lncRNA可以作为蛋白质-DNA相互作用的调控因子，也可以作为蛋白质-蛋白质相互作用的上游调控元件，可以调控蛋白质或微小RNA的转录翻译，增强或抑制其表达水平^[14-15]。有研究已经显示lncRNA可以参与各种生物学行为的调控过程，如细胞增殖、分化、凋亡和侵袭等，以及对部分代谢疾病的影响^[16]。然而，lncRNA在肾细胞癌中的特异性调控作用并没有进行过深入的探讨。

c-Myc蛋白在肝细胞癌中的激活可以诱导肝癌细胞的细胞周期阻滞和凋亡行为，诱导多种蛋白质编码基因的转录改变^[17]。本研究通过检测FILNC1在肾细胞癌的表达及c-Myc的表达进一步丰富了lncRNA在肾细胞癌中的发展模式，并鉴定新型的lncRNA和c-Myc共同介导肾细胞癌细胞的生物学行为，影响肾细胞癌的发展过程。有相关研究指出FILNC1可以调c-Myc影响肾癌细胞的生物学活性^[18]，对临床肾癌患者的预后检测发挥一定的指导作用，但是对肾癌细胞的生物学行为的直接作用无进一步研究。

近年来，越来越多的研究表明，lncRNAs的调节异常被证明可以在许多癌症类型的发展中起作用，可以用作生物预测标志物和预后因子^[19]。

qPCR检测发现FILNC1在肾细胞癌组织和细胞系中比相应的正常肾组织表达上调。且双荧光素酶实验发现FILNC1可以和c-Myc蛋白相互作用，FILNC1可以直接调控c-Myc的蛋白表达。以上结果表明，FILNC1表达可能与肾细胞癌患者的发展相关，甚至干扰肾细胞癌的发展进程，可能作为其独立预后因子，为临床上预测肾细胞癌情况提供参考。

Lewin等研究显示FILNC1的表达水平的降低可以导致肿瘤细胞生长缺陷、侵袭和迁移能力减弱、影响黑色素瘤细胞凋亡率^[20]。Ulitsky等也发现FILNC1可以直接调节食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭行为，同时影响AKT信号蛋白的激活，在体外实验同时证实了其效果^[21]。有实验揭示c-Myc可以对RNA分子进行转录后修饰，进一步影响RNA分子从细胞核转移到细胞质的过程^[22]。本实验完善了FILNC1和c-Myc在肾细胞癌中的表达模式，及FILNC1和c-Myc对肾细胞癌增殖和凋亡行为的直接调控作用，并在体外实验进行同步验证，证实了FILNC1在肾细胞癌中的作用。本实验存在一定的待完善步骤，可以进一步探讨FILNC1与相关信号通路的激活表达机制，明确FILNC1在肾细胞癌中的表达意义及限制机制。

综上，FILNC1在肾癌组织中高度表达并且在不同细胞株中表达不同，因此研究FILNC1的作用机制和方式对于发现肾细胞癌的诊断标志物非常有意义。