0 引言

重离子束是一种高传能线密度（linear energy transfer, LET）的射线，具有良好的深度剂量分布和较高的相对生物学效应，是目前临床放射治疗肿瘤最具前景的方法^[1-2]。相比较常规射线及电子束，具有深度分布剂量好、实现肿瘤靶向辐照等巨大优势，是一种可保护周围正常细胞的理想照射方式。本研究通过不同剂量重离子束对人舌鳞癌CAL27细胞进行辐照，探讨重离子对CAL27细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移、侵袭及P53、P56相关蛋白表达的影响，为重离子在口腔癌的进一步应用提供可靠依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

HF90 Heal Force培养箱（中国上海力申科学仪器有限公司）；超低温冰箱（Thermo Scientific, 美国）；HR-150AZ型精密电子天平（AND, 日本）；CX31型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；L420台式低速离心机（中国长沙湘仪离心机仪器有限公司）；荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；FACSCanto流式细胞仪（美国BD公司）；Countstar全自动细胞计数仪（中国上海睿钰生物科技有限公司）；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；青霉素-链霉素溶液（上海碧云天生物技术有限公司）；胰蛋白酶（美国Sigma公司）；胎牛血清（FBS，以色列BI公司）；FITC偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒；兔抗人P53、P65、VEGF抗体（美国Abcam公司）；人舌鳞癌细胞CAL27（上海交通大学第九人民医院口腔科）。

1.2 细胞培养

人舌鳞癌CAL-27细胞用含10%胎牛血清、1%青/链霉素的RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO₂的培养箱中常规培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 辐照条件

¹²C⁶⁺重离子束辐照于中国科学院兰州分院近代物理研究所HIRFL重离子终端进行，辐照能量为250 MeV，LET 75 keV，剂量率约为1 Gy/min。空白对照组辐照剂量为0，重离子辐照分为三组，参照参考文献^[3]将各组辐照剂量分别设为1、2、4 Gy。用空气电离室监测剂量，样品更换、辐照时间和剂量的数据获取由计算机控制。

1.4 MTT实验检测细胞抑制率

取对数生长期细胞在辐照前48 h接种到直径35 mm的培养皿中（1×10⁵个/皿），以0、1、2、4 Gy剂量¹²C⁶⁺离子照射，将辐照后的细胞用胰酶消化计数，以每孔2.5×10⁴个细胞接种至96孔板，每组设6孔重复；分别孵育12、24、48 h后，每孔加入10 μl MTT溶液，孵育4 h后，小心弃去上清液，加入100 μl DMSO，水平摇床振荡15 min，全程避光处理。于490 nm波长处测定吸光度。细胞存活抑制率=（OD_实验组-OD_空白组）/（OD_对照组-OD_空白组）。

1.5 Transwell细胞迁移实验

取经0、1、2、4 Gy辐照的每毫升5×10⁵个无血清细胞悬液，将400 μl该悬液加入Transwell上室，24孔板中加入600 μl含20%血清的RPMI 1640培养液，培养48 h后，用棉棒轻轻拭去上室细胞，甲醇固定30 min，结晶紫染色5 min，PBS洗涤3次，镜下随机选取5个视野进行结果观察^[4]。细胞迁移抑制率=（对照组迁移细胞数-实验组迁移细胞数）/对照组迁移细胞数×100%。

1.6 Transwell细胞侵袭实验

取经0、1、2、4 Gy辐照的每毫升1×10⁶个无血清细胞悬液，将200 μl该悬液加入Transwell上室，24孔板中加入500 μl含10%血清的RPMI 1640培养液，培养24 h后，用棉棒轻轻拭去上室细胞，甲醇固定30 min，结晶紫染色5 min，PBS洗涤3次，倒置显微镜下随机选取5个视野计数并拍照。细胞侵袭抑制率=（对照组侵袭细胞数-实验组侵袭细胞数）/对照组侵袭细胞数×100%

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

取经0、1、2、4 Gy辐照的每毫升5×10⁴个细胞悬液，常规培养48 h后消化、离心、PBS洗涤两次，弃上清液；一份加入100 μl Binding Buffer重悬，依次加入FITC标记AnnexinV 5 μl、PI 5 μl，避光15 min，转至流式检测管，加入400 μl PBS，上机进行凋亡检测；另一份依次加入PI染夜l ml（1g/L），室温避光放置30 min，上机进行细胞凋亡检测。

1.8 流式细胞术检测细胞周期

前期细胞处理提取过程同1.6；4℃预冷，75%乙醇固定过夜，含RNase及PI的染液染色30 min，上流式细胞仪测定DNA含量的变化^[5]。

1.9 划痕实验检测细胞迁移

（1）取生长状态良好的细胞，用含0.1% BSA的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为每毫升5×10⁵个，接种于35 mm直径培养皿，无血清培养液饥饿培养24 h；（2）当细胞长到融合的细胞层，以200 μl无菌Tip头作3条平行划痕，在辐照前用PBS洗液轻轻洗去脱落细胞，Nikon倒置显微镜拍照；（3）使用重离子束进行辐照；（4）辐照后36 h，在相同位置用Nikon倒置显微镜进行拍照；（5）辐照前后的划痕区域相对距离采用Image J软件进行测定，计算划痕迁移率^[6]。划痕迁移率=（T0时面积-Tt时面积）/T0时面积×100%。

1.9.1 克隆形成实验

（1）辐照前一天，用0.25%的胰蛋白酶溶液将生长良好的CAL27细胞制备成单细胞悬液，将其接种于直径60 mm培养皿中，接种细胞数为2 000个，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分散（每个剂量至少3皿）；（2）置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养24 h，待贴壁后使用重离子束辐照；（3）辐照后立即置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养14 d（每隔3d换一次液），待对照组出现克隆时终止培养，弃培养液，PBS洗2次，甲醇固定15 min后，Giemsa染液染色15 min，流水洗去染色液，空气中自然干燥；（4）对细胞培养皿中的克隆数进行计数，普通光学显微镜下集落细胞数 > 50个细胞计为1个克隆，克隆形成率使用3个培养皿的平均克隆数来进行评估^[6]。

1.9.2 Western blot检测蛋白表达

收集处理24 h后的各浓度组细胞，用RIPA裂解液冰上裂解细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。各样品取40 μg，经12%SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉（用TBST配制）封闭2 h，分别加入兔抗人P53、P65和VEGF一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加Dylight800标记羊抗兔二抗，室温下脱色，摇床上避光摇动孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。用Odyssey双色红外荧光扫描成像系统采集条带图像，使用Image J软件进行定量分析，以β-actin为内参。

1.10 统计学方法

所有实验数据均采用SPSS22.0统计软件进行分析，计量数据以均数±标准差表示。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 细胞抑制率的测定

MTT比色法显示，辐照剂量一定时，随时间的延长，细胞抑制率增加；时间一定时，随辐照剂量的增加，细胞抑制率增加，以4 Gy时增加最明显，时间-效应曲线见图 1。

2.2 辐照对CAL27细胞迁移的影响

结果表明，未辐照组中大量的CAL27细胞通过Transwell膜的孔隙迁移至膜的另一侧，而辐照后，CAL27细胞的迁移明显受到抑制，见图 2。经¹²C⁶⁺离子辐照，48 h后照射剂量在0、1、2、4 Gy时的迁移抑制率分别为0、28.34%、34.49%和42.57%。

2.3 辐照对CAL27细胞侵袭的影响

采用Transwell小室观察辐照对CAL27细胞侵袭活性的影响。结果表明，未辐照组中大量的CAL27细胞通过Transwell膜的孔隙侵袭至膜的另一侧，而经辐照后，CAL27细胞的侵袭明显受到抑制，见图 3。经¹²C⁶⁺离子辐照，24 h后辐照剂量在0、1、2、4 Gy时的侵袭抑制率分别为0、34.10%、45.46%和53.995%。

2.4 Annexin V荧光探针和流式细胞仪检测¹²C⁶⁺离子辐照对CAL27细胞凋亡的影响

¹²C⁶⁺离子辐照48 h后，辐照剂量在0、1、2、4 Gy组发生凋亡的细胞所占百分比分别为（1.875±0.4313）%，（8.44±0.4101）%，（10.01±1.4284）%, （14.25±1.4001）%；随着¹²C⁶⁺离子辐照剂量的增加，凋亡细胞所占比例增加，见图 4。

2.5 流式细胞仪检测¹²C⁶⁺离子辐照对CAL27细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果显示，2、4 Gy组的CAL27细胞在G₀/G₁期所占细胞比率较0、1 Gy组高，并且4 Gy组出现明显的凋亡峰，见表 1。说明2、4 Gy组在¹²C⁶⁺离子辐照后，CAL27细胞复制停滞于G_0/G₁期，发生了细胞凋亡。

2.6 划痕实验检测细胞迁移能力

¹²C⁶⁺离子辐照36 h后，辐照剂量0、1、2、4 Gy的细胞穿过滤膜率分别为50.12%、47.17%、35.03%和21.99%。随着¹²C⁶⁺离子辐照剂量的增加，重离子束辐照降低了CAL27细胞的迁移能力，见图 5。

2.7 ¹²C⁶⁺离子辐照对CAL27细胞株克隆形成能力的影响

不同剂量¹²C⁶⁺离子辐照对CAL27细胞株的克隆形成能力均有显著的抑制效果，见图 6。

2.8 ¹²C⁶⁺离子辐照后CAL27细胞株中P53、P65和VEGF蛋白的表达

¹²C⁶⁺离子辐照24 h后，CAL27细胞株中P53、P65和VEGF的表达随剂量增加逐渐下降，见图 7。

3 讨论

舌癌是最常见的口腔癌，多为鳞癌。常为溃疡型或浸润型。一般恶性程度较高、生长快、浸润性强，常波及舌肌，致舌运动受限。舌癌的治疗以综合疗法为主。其中放疗作为治疗舌癌的重要手段之一，可避免手术对组织的过度损伤和破坏，使得肿瘤部位的器官和功能得以保留，对于提高患者的生存质量具有重要意义，但常规放疗面临增强某些恶性肿瘤侵袭和转移能力的挑战^[7-8]，因此，寻求更优的放疗方式具有重大意义。

本研究通过MTT法检测不同时间段及不同剂量组¹²C⁶⁺离子束对人舌鳞癌CAL27细胞的作用，结果表明其对CAL27细胞具有明显的体外抑制作用，且呈现时间-剂量依赖性。

凋亡作为细胞死亡的重要方式之一，其过程受到基因程序化的调控。本实验通过流式细胞术检测¹²C⁶⁺离子束对CAL27细胞凋亡诱导情况，结果表明随着剂量的增加，其凋亡率显著性增加。同时，细胞周期检测结果显示2、4 Gy组G₀/G₁期所占细胞比率显著高于0、1 Gy组，使CAL27细胞发生G_0/G₁期阻滞，诱导细胞凋亡的发生；其生物学效应为重离子束引发DNA损伤，但具体机制仍不明确。

细胞迁移在血管新生及肿瘤转移等过程中起关键作用。本研究通过Transwell小室及划痕实验结果均表明¹²C⁶⁺离子束辐射能显著降低CAL27细胞迁移能力，可能与放射治疗可直接破坏肿瘤新生血管有关；同样Transwell小室实验显示，随着辐照剂量的增多，CAL27细胞的侵袭能力受到明显抑制。

P53基因作为常见的抑癌基因，在多种肿瘤中存在表达及突变，分为野生型P53和突变型P53。两者在肿瘤发生、发展的调控机制上存在明显差异。野生型P53可通过NF-κB及信号转导及转录刺激因子（single transducer and activators of tran-scription, STAT）等的表达来抑制IL-6、环氧合酶-2、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide syn-thase, iNOS）等的产生与释放，进而抑制炎性反应的产生，最终抑制肿瘤的发生和转移。而NF-κB主要存在或表现形式为P65和P50，p65参与基因转录的起始调节，并可促进p50与DNA结合；当p65与细胞质内抑制蛋白IκB结合，可掩盖p50上核定位信号，对于促成肿瘤细胞发生发展具有重要作用^[9-11]。本研究通过Western blot实验观察不同剂量处理后的CAL27细胞培养24 h后P53、P65、VEGF的蛋白表达量，结果显示随不同剂量的辐照，以上蛋白表达含量明显降低（P < 0.05），其蛋白含量的改变呈现出一定的剂量相关性。

综上，本研究初步证明重离子辐射对人舌鳞癌CAL27细胞增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭及P53、P56、VEGF表达的影响，为重离子更好地应用于口腔舌鳞癌的治疗提供了一定依据。尽管目前重离子抗肿瘤已得到广泛认识，在肝癌、肺癌及口腔腺样囊性癌等多种肿瘤有所研究，且与其他放疗方式相比，其良好的剂量分布和靶向高生物学效应^[12]，以及对周围组织保护作用，我们应更进一步从分子通路去探究，使其更精准地用于肿瘤的治疗。