0 引言

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球发病率排名第三的恶性肿瘤^[1]，目前结直肠癌在我国每年新发病例大约为37.5万，每年死亡病例约为19.1万^[2]。近年来在结直肠癌治疗领域，贝伐珠单抗开启了晚期CRC靶向治疗的先河^[3]。瑞戈非尼的获批上市也为晚期CRC患者带来新的治疗选择^[4]。

目前，CRC术后辅助化疗仍是以卡培他滨为基础的化疗方案^[5]。卡培他滨在体内需经胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase, TYMP）代谢转化为5-Fu^[6]。研究表明，TYMP酶在肿瘤细胞内和血小板衍生内皮细胞生长因子结构非常相似^[7]，具有促进肿瘤血管新生和转移的作用^[8]。所以，很多研究也发现在不同的肿瘤中，TYMP都是高表达^[9]。

TYMP基因位于染色体22q13.33，包含10个外显子。目前在中国人群中对于该基因多态性的研究很少^[6]。Huang等学者探讨了晚期胃肠道肿瘤中TYMP基因多态性位点rs11479的临床意义^[10]。研究表明，在晚期胃肠道肿瘤中，携带T等位基因的患者TYMP基因的表达水平较高。然而，目前在结直肠癌辅助化疗领域，尚没有TYMP基因rs11479位点和预后的关联研究。因此本研究旨在评估TYMP基因rs11479位点与接受卡培他滨为基础辅助化疗的CRC患者总生存期的相关性，探讨该位点和未处理的结直肠癌组织中TYMP基因表达的关联性。

1 资料与方法 1.1 实验设计及入组患者

本研究为回顾性分析，入组的是从2010年1月到2016年12月在郑州人民医院普外五科接受手术切除治疗的198例CRC患者。入组标准包括：（1）年龄≥18岁，ECOG评分0~2分，心功能正常（左心室射血分数 > 50%），肾功能正常（肌酐≤1.5×正常值上限（upper limits of normal, ULN）），骨髓功能正常（中性粒细胞计数≥1.5×10⁹/L，血小板计数≥100×10⁹/L，血红蛋白≥9 g/dL）；（2）预期寿命至少3月。排除标准为：家族性腺瘤性息肉病，其他遗传性CRC综合征，失访的患者。

辅助联合化疗方案（XELOX方案）：术后3~4周，卡培他滨：1 000 mg/m²，口服，每天2次，第1~14天，每21天为一周期。奥沙利铂：80~130 mg/m²，静脉滴注，第1天。卡培他滨单药口服方案同联合方案。辅助化疗结合患者情况通常为6~8周期。根据治疗过程中出现的血液学或者非血液学毒性调整相应的给药剂量，一旦发生可能威胁生命的毒性反应时治疗中止。本研究得到郑州人民医院伦理委员会的批准，每例入组患者均签署知情同意书。

1.2 血液样本收集及基因分型

收集患者外周血样本4 ml，苯酚氯仿法提取基因组DNA，-80℃保存。采用Real-time PCR法对TYMP基因5633C > T（rs11479）位点进行基因分型。每个PCR反应体系中用标准的溶液配比进行。等位基因分型采用Fast ABI-7500（美国应用生物系统公司）进行，按照说明书标准操作步骤对每个样本进行基因分型。设置阴性参照，部分样本的分型结果通过酶切的方法进行验证。

1.3 组织样本收集及TYMP表达分析

手术过程中收集每例患者被切除的结直肠癌组织标本，最终纳入研究的为87例组织标本，液氮保存，TRIzol试剂提取RNA，上海罗氏Real-time PCR仪进行TYMP mRNA表达实验，GAPDH mRNA表达用作内参。TYMP mRNA用相对定量法2^-ΔΔCt进行计算^[11]。

1.4 肿瘤部位及手术类型

122例（61.62%）结肠癌，其中45例右半结肠，12例横结肠，65例左半结肠；76例（38.38%）直肠癌。

1.5 统计学方法

本研究当中所有的变量均采用SPSS统计分析软件（IBM, Armonk, NY）进行相应的统计分析。χ²检验分析多态性位点基因分型是否符合哈迪温伯格平衡。在基线临床资料当中，离散型的变量和rs11479位点不同基因型的分布采用χ²检验，当数据较少时用Fisher精确检验。连续型的变量和rs11479位点不同基因型的分析采用非参检验的Mann-Whitney U（两组间）或者Kruskal-Wallis H（多组间）检验。Kaplan-Meier曲线比较不同基因型患者OS的差异，曲线间的差异用对数秩检验进行比较。总生存期（OS）的计算从手术当日到患者任何原因出现的死亡或者最后一次随访结束。多变量分析时，对OS构建采用Cox风险比例模型，用向后LR的选择步骤来筛选和校正潜在的混杂变量。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 198例患者基线临床资料及rs11479位点基因分型情况

入组的198例患者的基线临床资料，见表 1，大部分患者肿瘤分化中等（68.18%）。所有患者均接受术后辅助化疗，其中，大部分为XELOX方案（卡培他滨联合奥沙利铂）（67.17%），余为卡培他滨单药方案（32.83%）。

rs11479位点的基因分型结果为：野生CC型126例（63.64%），CT型61例（30.81%），TT型11例（5.55%），最小等位基因频率为0.21，三种基因型分布频率符合哈迪温伯格平衡（P=0.323）。考虑到突变纯合子TT型患者相对较少，后期分析中，将CT和TT型患者合并。该位点不同基因型在基线临床资料中的分布基本均衡，见表 1。

2.2 TYMP基因rs11479位点对预后的影响

CT和TT型患者合并共计72例。在针对OS的单变量分析当中，野生型CC和突变型CT及TT型的两组患者在OS上差异有统计学意义，野生型CC型的患者相对于CT和TT型的患者具有较差的OS（P=0.009），见图 1。将可能影响OS的风险因素，如年龄、性别、肿瘤分化情况、病理分期以及rs11479位点纳入Cox风险比例模型。经过多变量校正，rs11479位点对OS独立的影响意义依然存在，并具有显著的统计学意义（HR=0.68，P=0.015），其他的在Cox模型当中具有统计学差异的变量为年龄（P=0.005）、病理分期（P < 0.001），见表 2。

2.3 TYMP基因rs11479位点对TYMP mRNA表达的影响

此外，本研究还纳入了87例术后切除的癌组织标本，通过提取的RNA对TYMP的表达情况进行分析，并与rs11479位点的基因型作了相关性统计。在87例癌组织标本中，CC型55例、CT型27例、TT型5例，三种基因型分布频率同样符合哈迪温伯格平衡（P=0.495）。TT型患者相对较少，同样将TT型和CT型患者合并。野生型CC型相对于突变型CT和TT型患者来说，TYMP mRNA表达水平明显偏低，差异有统计学意义（P=0.019），见图 2。

3 讨论

本研究纳入了198例经过手术切除的结直肠癌患者，通过对TYMP基因rs11479位点基因分型进而和患者的预后进行关联性分析，发现该位点野生型CC基因型患者相对于携带T等位基因的CT和TT基因型患者来说具有显著较差的OS，并通过对87例组织标本的TYMP基因mRNA表达水平分析发现了该位点不同的基因型患者的mRNA表达水平呈现较大的差异。rs11479位点可能通过影响TYMP基因mRNA的表达从而影响接受含卡培他滨辅助化疗方案的CRC患者的预后。

结直肠癌是异质性很强的恶性肿瘤^[12]。现有大量可以预测结直肠癌疗效的生物标志物的研究成果：2015年报道的CYP3A5多态性对FOLFIRI治疗结果的影响^[13]；2017年报道的四氢叶酸转移酶MTHFR多态性对5-Fu疗效的影响^[14]；2016年报道的胸苷酸合成酶TS多态性对结肠癌一线5-Fu化疗疗效的影响^[15]。

本研究首次报道了在中国CRC患者接受卡培他滨为基础的辅助化疗方案时，TYMP基因rs11479位点的T等位基因携带者可通过影响该基因的表达，从而使得该基因型患者对卡培他滨更为敏感，进而从卡培他滨的辅助化疗当中获益。我们的研究结果和先前Huang团队的研究结果基本一致^[10]，他们将晚期胃肠道肿瘤患者纳入研究，结果表明rs11479位点的T等位基因携带者和较高的TYMP基因表达水平有关，这和本研究中CT/TT型患者的TYMP mRNA表达水平高较一致。然而，可能是因为样本量较少，该研究并没有发现该位点和OS的明显相关性。另外，Jennings团队的一项研究结果发现rs11479位点的T等位基因携带者和接受卡培他滨治疗的CRC患者的较多不良反应有关，和本研究结果部分相似，都表明rs11479位点的T等位基因携带者对卡培他滨可能更为敏感^[16]。另一方面，在TYMP基因表达水平和CRC预后的关系上，目前的研究尚存在较大的争议。本研究表明TYMP mRNA高表达的人群更能从卡培他滨的治疗中获益，从而具有较好的预后，这和Lu团队的研究结果^[17]一致。该研究纳入了57例一线接受卡培他滨联合紫杉醇治疗的晚期胃癌患者，分析了TYMP mRNA的表达水平与治疗的反应率以及OS的关系，发现高表达的人群反应率较高，OS较好^[17]。然而，也有很多研究结果发现，TYMP基因是促进肿瘤血管新生的重要因子，因此该基因高表达时通常伴随了较高的肿瘤负荷，肿瘤更易复发和转移，预后更差^[18]。但是这些研究当中并没有观察卡培他滨的治疗情况。TYMP基因在体内具有双重作用，一方面通过刺激肿瘤细胞血管新生来促进肿瘤生长，另一方面，该基因是卡培他滨的重要代谢基因，是5-Fu类化疗药物发挥细胞毒作用的关键基因，从而具有杀灭肿瘤细胞的作用。

本研究采用血液当中提取的DNA来进行基因分型。因为多态性位点属于生殖细胞系突变所以血液样本即可进行检测，样本容易获取后期也便于临床推广。总之，本研究发现了在中国CRC人群当中TYMP基因rs11479位点是一个独立的OS影响因素。当然，本研究也有部分局限性，首先纳入研究的样本量不大，没有在大样本当中评估该位点的预后指导意义。另外，研究为回顾性分析，有一些偏倚无法避免。不过该研究比较充分地对rs11479位点的预后影响意义进行了评估，同时也从TYMP mRNA表达层面揭示了该位点造成预后差异的部分原因，对CRC患者预后的指导有一定意义。