0 引言

β1, 3-乙酰葡萄糖胺转移酶3（β1, 3-N-acetylglucosaminyltransferase-3, B3GNT3）是β3GlcNAcT家族成员之一。β3GlcNAcT家族是一类Ⅱ型跨膜蛋白，其与组织恶性转变有关^[1-3]。近年来有研究报道，β3GlcNAcT家族成员在肿瘤组织中异常表达^[4-5], 如B3GNT3在宫颈癌细胞、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、结肠癌细胞中表达^{[1, 6]}。Ho等报道B3GNT3可通过抑制FAK、Akt和ERK信号通路来抑制神经母细胞瘤细胞迁移及侵袭^[6]。B3GNT3主要分子生物学功能为调节半乳糖基转移酶活性，影响肿瘤细胞能量代谢，在L-选择素配体生物合成中起主导作用，从而影响肿瘤细胞生存和转移。这些研究结果提示B3GNT3的表达与肿瘤发生发展有关。然而，目前有关B3GNT3在人体肿瘤组织中异常表达的研究并不多见，检索国内外文献，未发现有关B3GNT3表达与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）之间联系的研究报道。本研究通过TCGA公开数据库，应用Western blot及免疫组织化学法检测肺正常组织和NSCLC组织中B3GNT3蛋白的表达情况，探讨其与NSCLC患者临床病理特征及预后之间的关系，为肿瘤的早期诊断和治疗提供新的靶点。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集2015年7月—2015年12月在湖北省肿瘤医院进行手术的60例NSCLC患者肿瘤组织，所有组织均经术后病理检查确诊；以肺大泡、炎性假瘤患者（非肿瘤）22例作为正常对照肺组织。其中肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）38例，肺鳞癌（squamous cell lung carcinomas, SCLC）22例，男40例，女20例，年龄30~78岁，平均年龄57岁。按2004年WHO制定的肺肿瘤分类标准进行组织分化程度评估，高分化癌13例、中分化癌29例、低分化癌13例和未分化癌5例；按TNM分期标准（2009年AJCC标准，第7版）分为：Ⅰ期11例、Ⅱ期30例、Ⅲ期19例；无淋巴结转移者39例，有淋巴结转移者21例。60例患者术前均未行化疗或放疗，排除糖尿病及其他代谢性疾病。正常肺组织离体后，立即剔除坏死部分，余下组织经病理证实为正常肺组织。肺肿瘤标本和正常肺组织离体后立即取材，将部分组织用中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋及切片，用于免疫组织化学法检测；另外一部分于液氮中浸置30 min后，转至-80℃冰箱保存，用于提取组织蛋白，进行Western blot法检测。本研究涉及的所有资料均经湖北省肿瘤医院伦理委员会同意批准，所有患者均知情并签订同意书。

1.2 主要试剂

兔抗人B3GNT3多克隆抗体（18098-1-AP，武汉Proteintech公司）；兔抗人actin抗体（武汉Proteintech公司），免疫组织化学试剂盒（美国Dako公司）。

1.3 方法

1.3.1 Western blot法

冰冻组织标本用RIPA裂解液裂解并用匀浆器碾碎，低温超速离心，BCA法测定蛋白浓度，用10%SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，一抗B3GNT3（1:1 000），actin（1:2 000），4℃孵育过夜，碱性磷酸酶标记二抗（1:5 000）37℃孵育1 h，ECL显影液均匀滴加在PVDF膜上，在凝胶化学发光成像仪器上进行曝光。用ImageJ灰度分析软件计算泳道对应的灰度值，通过计算目的条带与内参条带灰度值比进行统计分析。

1.3.2 免疫组织化学法

按照免疫组织化学试剂盒说明书操作。3 μm厚连续肺肿瘤标本和肺正常组织切片，在63℃烤箱中烘烤70 min，经二甲苯、梯度乙醇溶液脱蜡，高压锅修复抗原，冷却至室温；滴加10%山羊血清封闭30 min，以减少非特异性染色，组织滴加一抗B3GNT3（1:300），4℃孵育过夜。滴加生物素标记的二抗工作液，37℃反应30 min，DAB显色5~10 s。B3GNT3阳性表达物定位于细胞质和细胞膜，细胞出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。每个标本随机选取10个高倍（×400）视野，每个视野计数100个细胞。根据显色程度判断阳性程度：标本无色为0分；淡黄色细颗粒为1分；棕黄色颗粒为2分；棕黑色粗颗粒为3分。根据阳性细胞在细胞中所占比例分为：阳性细胞数≤25%为1分；25%~50%为2分；> 50%~75%为3分；> 75%为4分。两类分数乘积0~6分为低表达；> 6分为高表达。

1.4 TCGA数据库数据分析

本研究通过在线TCGA数据库（UALCAN: https://ualcan.path.uab.edu/analysis.html.）分析B3GNT3基因在肺癌标本中的表达量，以及B3GNT3基因在肺腺癌、肺鳞癌组织中表达水平与NSCLC患者临床病理特征之间的关系。

1.5 统计学方法

采用GraphpadPrism6软件进行生存曲线分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 B3GNT3基因在非小细胞肺癌中的表达

通过网络在线TCGA数据库，从肺腺癌组织芯片数据中得到B3GNT3基因表达明显上调，见图 1A；同样，从515例原发肺腺癌组织中也证实B3GNT3基因表达明显上调，见图 1B。同时，发现原发肺鳞癌组织（505例）B3GNT3基因表达也明显上调，见图 1C。这些结果说明B3GNT3基因在NSCLC中表达明显上调，差异有统计学意义（P < 0.001）。

2.2 B3GNT3蛋白在人非小细胞肺癌组织中的表达情况

免疫组织化学法检测结果显示，B3GNT3蛋白在肺腺癌细胞和肺鳞癌细胞中高表达，在正常肺组织中的肺上皮细胞几乎不表达，见图 2A~C。进一步通过Western blot法检测，同样发现肺腺癌和肺鳞癌组B3GNT3蛋白表达量明显高于正常肺组织组（P值分别为0.0086, 0.0038），见图 2D、E。

2.3 B3GNT3表达与NSCLC患者临床病理特征间的关系

通过在线分析TCGA数据库，发现肺腺癌和肺鳞癌组织中B3GNT3蛋白阳性表达与NSCLC患者年龄、性别、吸烟情况、种族、肿瘤TNM分期均无明显关系（P > 0.05），见图 3。

2.4 B3GNT3的表达及与NSCLC患者预后的关系

通过在线分析TCGA数据库来探讨B3GNT3表达与NSCLC患者预后之间的关系，将肺腺癌分为高表达组（n=124）和低表达组/中表达组（n=378)，得到B3GNT3高表达组患者生存时间明显短于低表达组/中表达组患者（P=0.0066），见图 4A。同样，将肺鳞癌分为高表达组（n=123）和低表达组/中表达组（n=371），得到B3GNT3高表达组患者生存时间明显短于低表达组/中表达组患者（P=0.022），见图 4B。为了进一步验证肺癌细胞B3GNT3表达与NSCLC患者预后之间的关系，随访我院60例NSCLC患者，截至2017年10月30日，随访率为100%，随访时间为4~51月，生存时间从患者手术后开始计算，至患者死亡或随访结束，中位随访时间为29.5月。根据免疫组织化学评分将60例NSCLC患者分为高表达组（n=24）和低表达组（n=36），随访期间有25例患者死亡。Kaplan-Meier曲线法分析结果显示B3GNT1蛋白高表达组患者生存预后明显差于B3GNT3蛋白低表达组患者，差异有统计学意义（P=0.017），见图 4C。

3 讨论

B3GNT3参与了聚n-乙酰亚胺链的生物合成和二聚唾液酸Lewis A骨架结构的生物合成，近年来才有关于B3GNT3参与肿瘤发生相关作用机制的报道^{[3, 6]}。Shiraishi等^[3]证实B3GNT3在结肠癌细胞系Colo205表达上调，也有研究发现，B3GNT1表达下调与胰腺导管腺癌不良预后有关^[4]，而有报道发现B3GNT5在脑胶质瘤中高表达，B3GNT7在卵巢癌和结肠癌细胞中高表达^{[5, 7-8]}。Cerhan等^[9]发现B3GNT3与机体免疫功能和炎性反应有关，它在淋巴细胞移行与迁移方面发挥重要作用，因此可促进非霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞生存和转移。另有研究表明B3GNT3基因座与胰腺癌患者CA19-9水平有关^[10]。这些结果表明B3GNT3蛋白是一个与人类多种肿瘤相关的癌蛋白，在某些肿瘤类型中发挥着致癌作用。然而，Ho等^[6]研究发现B3GNT3过表达抑制T细胞抗原形成和SK-N-SH肿瘤细胞表型，包括肿瘤细胞迁移和浸润。还有研究发现，B3GNT3表达可降低FAK、Src、paxillin、Akt和ERK1/2磷酸化。表明B3GNT3可能在抑制神经母细胞瘤的恶性特性方面发挥关键作用^[10]。而B3GNT3在肺癌中作用如何，目前不清楚，尚无文献报道。而本研究结果表明B3GNT3无论在肺腺癌还是肺鳞癌中表达量明显高于正常肺组织，差异有统计学意义（P < 0.01），表明B3GNT3蛋白的高表达可能与NSCLC的发生、发展有关。Zhang等^[1]研究表明B3GNT3表达与早期宫颈癌患者HPV感染、FIGO分期、肿瘤大小、淋巴结转移等临床特征相关，B3GNT3表达与早期宫颈癌患者生存预后相关。而本研究发现，B3GNT3蛋白阳性表达与NSCLC患者的临床病理特征之间无明显关系，这可能与组织的差异性有关，也可能与样本量有关，需要进一步研究。我们通过TCGA数据库分析发现B3GNT3表达高低与肺腺癌、肺鳞癌生存预后明显相关，而分析随访的60例NSCLC资料发现，B3GNT3高表达组患者的术后总生存时间明显短于B3GNT3低表达组患者（P < 0.05），与Zhang等研究报道结果一致。因本研究样本量偏少，未进一步行Cox比例风险模型多因素生存分析，B3GNT3蛋白表达是否为NSCLC患者术后总体生存时间的独立影响因素，仍需进一步研究。

总之，本研究无论是从TCGA数据库还是NSCLC患者标本都证实了B3GNT3蛋白在NSCLC组织中高表达并与NSCLC患者的预后有关，其具体的作用机制有待进一步研究。B3GNT3蛋白水平可作为NSCLC患者预后的一个重要指标。