0 引言

肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是威胁人类生命安全的常见肿瘤，中国发病总数占全球一半以上，癌细胞的高增殖活性及侵袭转移是影响患者预后的主要因素^[1-3]。深入研究癌细胞增殖转移的分子机制，筛选有效的治疗性分子靶点，对提高肝癌临床疗效改善患者预后具有重要意义。由于微环境中众多因素的刺激，肝癌细胞内癌基因或抑癌基因发生突变，导致一系列信号转导和转录活化相关因子在癌细胞内异常激活或失活，促进癌细胞的增殖、侵袭和转移，并抑制癌细胞的凋亡，进一步增强了肝癌的恶性生物学行为^[4]。除基因改变机制，近来较多的研究显示表观遗传学调控失衡也促进了肝癌细胞异常增殖^[5]。DNA甲基化、组蛋白修饰及miRNA调控异常均属于表观遗传学调控失衡。研究报道HCC组织出现异常的DNA甲基化位点异常富集，这些位点包括BMP2-4、CDKN2A、CDKI、DAPK等，它们在细胞生长、基因表达、细胞凋亡的信号通路中发挥重要的作用^[6-7]。

MLLT3（myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia; translocated to 3），基因别名AF9，属于组蛋白甲基转移酶家族成员，细胞生物学和功能基因组学研究发现，人AF9与H3K9ac修饰在全基因组水平有强烈的共定位，并且调控了包括MYC、BMP2、HOXA基因簇在内的细胞增殖分化基因的表达^[8]，从而参与调节细胞的增殖、分化和凋亡。AF9基因主要突变的方式是与MLL基因融合，形成MLL-AF9，在白血病的形成和发展中起着关键作用^[9-10]。但是MLLT3/AF9与实体肿瘤之间的研究甚少，尤其是与肝癌增殖和侵袭之间的关系尚未见报道。

1 资料与方法 1.1 资料与试剂

100例肝癌及对应癌旁组织（距离肿瘤边缘2~3 cm）来源于南昌大学第二附属医院肝胆外科2016年9月至2017年11月行手术切除的肝癌患者，女46例、男54例，患者年龄40~75岁，每位患者签署知情同意书，并经南昌大学第二附属医院伦理委员会批准。

Real-time PCR试剂盒（AQ141）、CCK-8试剂盒（FC101）购自北京TransGen Biotech公司；Transwell小室购自美国Millipore公司；凝胶制备试剂盒（AR0138）、总蛋白提取试剂盒（P1250）、蛋白定量试剂盒（P1511）、超敏发光试剂盒（S6009）等购自中国南昌CELL SCIENTIFIC公司；Anti-AF9抗体（ab154492, WB专用一抗二抗稀释液稀释，稀释浓度1:500）、GAPDH抗体（AF7021，WB专用一抗二抗稀释液稀释，稀释浓度1:500）、Goat Anti-Rabbit IgG（BA1045，TBST稀释，稀释浓度1:10 000）购自美国Abcam公司；肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、Hu7、Bel-7402细胞、HitransG P（REVG003）和慢病毒载体（LV-MLLT3-RNAi）均由中国上海吉凯基因生物技术公司提供。肝癌细胞株分别在含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM（Biological Industries）于37℃、5%CO₂环境下贴壁培养、传代，备实验使用。实验分为三组：（1）LV-MLLT3-RNAi组（LV-MLLT3-RNAi）；（2）空白对照组（无转染）；（3）阴性对照组（hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）。

1.2 Real-time PCR检测MLLT3/AF9 mRNA的表达

根据总RNA抽提试剂盒（ET111）说明书提取总RNA，然后用核酸蛋白分析仪（BioPhotometer，德国艾本德）对RNA浓度和纯度测定，在梯度PCR仪（170-9703，美国Bio-Rad）上，反应条件：42℃ 15 min，85℃ 5 s，反转录合成cDNA，参考Real-time PCR试剂盒（AQ141）说明书加样，反应条件：94℃ 30 s，94℃ 5 s，60℃ 30 s，40周期，内参为β-actin，于荧光定量PCR分析仪（BJ001266，美国ABI）进行分析，根据ct值计算MLLT3/AF9 mRNA的相对表达量（ΔΔct值），实验重复3次。

1.3 Western blot检测MLLT3/AF9蛋白的表达

按照总蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白，检测蛋白浓度后加入缓冲液，经100℃煮沸15 min，变性后上样，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，采用半干膜转仪（TE70XP，美国Hoefer），将电泳产物转移至PVDF膜上，转膜后用5%的牛奶封闭2 h，通过TBST洗过（室温，3次×10 min）后，加入Anti-AF9抗体（ab154492，稀释浓度1:500）、GAPDH抗体（AF7021，稀释浓度1:500）4℃孵育过夜，TBST洗过（室温，3次×10 min）后，Goat Anti-Rabbit IgG（BA1045，稀释浓度1:10 000）室温孵育1 h，TBST洗过（室温，3次×10 min）后，最后浸入超敏发光试剂（S6009）中约1 min（室温），显影成像，使用Image J进行灰度值分析比较，实验重复3次。

1.4 慢病毒感染及引物设计

将对数生长期的SMMC-7721细胞消化重悬后，按1×10⁵个每升密度接种于24孔板，生长过夜（37℃、5%CO₂），等24孔板铺满30%~40%时，吸除培养液，换新鲜的培养液，根据细胞数量加入MOI为20的病毒液，混合均匀后即可放入培养箱培养，24 h左右可换液，48 h后，在荧光显微镜（100×）下观察细胞中绿色荧光蛋白表达情况，计算转染细胞数及转染效率，并筛选稳定株。MLLT3/AF9引物序列：正义链：5’-GGTACGCTGGCTTCATCTTGC-3’，反义链：5’-AGGTGATTCACTGGTGGGTGG-3’，β-actin正义链：5’-GTCATTCCAAATATGAGATGCGT-3’，反义链：5’-GCTATCACCTCCCCTGTGTG-3’。

1.5 CCK-8法检测SMMC-7721细胞的增殖能力

胰蛋白酶消化三组对数期细胞，离心并制成细胞悬液，通过细胞计数调整浓度至6×10⁴个每毫升，取三种细胞悬液分别加入到96孔板中，每孔100 μl，空白对照组、阴性对照组和LV-MLLT3-RNAi组分别设计6个复孔，培养24 h（37℃、5%CO₂的条件下培养），分别在第1、2、3、4和5天的时候，每孔加入10 μl CCK-8溶液（不要产生气泡），在多功能酶标仪（FC，美国Thermo Fisher Scientific公司）上选择450 nm波长测定各组细胞吸光值（OD值），最后统计数据和绘制增殖曲线，实验重复3次。

1.6 Transwell检测SMMC-7721细胞的侵袭能力

将冻存于-80℃冰箱的BD matrigel 4℃过夜（24 h），变成液态，无血清培养液和基质胶按1:5稀释，每孔加50 μl，在37℃培养箱中1 h，取对数生长期的三组细胞，用不含血清的培养基调整细胞数为1×10⁶个每毫升，取100 μl细胞接种于Transwell上室内，每组设3个复室，下室加入含15%小牛血清的培养液500 μl，37℃、5%CO₂培养箱中培养24 h后，用棉签将滤膜上层的细胞抹去，滤膜以甲醇固定30 min，用0.5%结晶紫（双蒸水稀释）染色15 min，PBS清洗后，100倍光学显微镜下拍照后，Image Pro Plus计算每个视野的细胞数，求平均值，实验重复3次。

1.7 划痕实验检测SMMC-7721细胞迁移能力

将三组处于对数期的细胞，接种于6孔板，当细胞生长至90%左右时，弃去培养液，用10 μl移液器的枪头沿培养板底部做“一”字划痕，划痕要垂直、均衡、相同。用PBS洗涤脱落的细胞，重新加入无血清的培养液，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养，于0 h和24 h倒置显微镜观察并拍照，Image J计算划痕愈合率，实验重复3次。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料经检验符合正态分布，采用（x±s）表示；三组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MLLT3/AF9表达与肝癌患者临床病理参数的关系

临床资料的统计分析表明，MLLT3/AF9的阳性表达率与年龄、性别、HBsAg、肝硬化无相关性（P > 0.05），与肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移有显著相关（P < 0.05），见表 1。

2.2 MLLT3/AF9 mRNA与蛋白在肝癌组织与癌旁组织中的表达

Real-time PCR检测肝癌组织中的MLLT3/AF9 mRNA表达水平（5.50±1.0）显著高于癌旁组织（1.25±0.50），差异有统计学意义（P=0.000），见图 1；Western blot结果显示与癌旁组织（0.493±0.22）相比，肝癌组织中MLLT3/AF9蛋白表达水平（1.546±0.59）显著升高，差异有统计学意义（P=0.000），见图 2。

2.3 MLLT3/AF9 mRNA在肝癌细胞系中的表达

Real-time PCR结果显示在肝癌细胞系SMMC-7721、Hu7、BEL-7402和HepG2细胞的MLLT3/AF9 mRNA的相对表达水平为（8.10±0.60）、（7.60±0.02）、（7.70±0.20）和（7.60±0.16），见图 3。

2.4 慢病毒感染

48 h后在荧光显微镜下（100×）观察，显示LV-MLLT3-RNAi组SMMC-7721细胞感染率达80%以上且细胞状态正常。

2.5 三组肝癌SMMC-7721细胞中MLLT3/AF9 mRNA的表达

Real-time PCR结果显示LV-MLLT3-RNAi组与空白对照组和阴性对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.0001），空白对照组和阴性对照组相比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见图 4。

2.6 三组肝癌SMMC-7721细胞中MLLT3/AF9蛋白的表达

Western blot研究结果显示LV-MLLT3-RNAi组中MLLT3/AF9蛋白表达量明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（P < 0.0001）；空白对照组和阴性对照组中MLLT3/AF9蛋白表达量差异无统计学意义（P > 0.05），见图 5。

2.7 细胞增殖能力

CCK-8法检测结果显示LV-MLLT3-RNAi组SMMC-7721细胞在第5天时的OD值为（0.34±0.019），明显低于空白对照组（0.77±0.05）与和阴性对照组（0.71±0.03），差异有统计学意义（P < 0.001），空白对照组和阴性对照组相比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见图 6。

2.8 细胞侵袭能力

Transwell实验结果显示LV-MLLT3-RNAi组穿膜细胞数（89.5±17.2）明显少于阴性对照组（180±11.5）及空白对照组（165.2±10.0），差异有统计学意义（P < 0.0001），而空白对照组和阴性对照组穿膜细胞数相比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见图 7。

2.9 细胞划痕的比较

细胞划痕实验结果显示LV-MLLT3-RNAi组（0.238±0.05）SMMC-7721细胞划痕愈合率明显低于阴性对照组（0.551±0.11）和空白对照组（0.682±0.04），差异有统计学意义（P=0.003），空白对照组和阴性对照组划痕愈合率比较，差异无统计学意义（P=0.234），见图 8。

3 讨论

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤第二位^[6-8]，肝癌细胞的恶性生物学特性为高增殖性和侵袭性，其发生发展的机制仍不清楚。MLLT3/AF9属于组蛋白甲基转移酶家族成员，定位于3号染色体上（9p22）^[11]，该基因全长6 704 bp，主要在白血病、淋巴瘤等组织中表达，并且足以引发急性白血病，其中潜在的二级突变被快速获得MLL和AF9野生型蛋白在胚胎发生和造血中起重要作用^[12]，是导致靶基因转录起始（MLL）和延长（AF9）的蛋白质复合物的部分^[13]。MLL-AF9是婴幼儿AML中最常见的融合基因，特别是与单核型AML（M5）相关^{[4, 14]}。Shibata等发现MLLT3/AF9基因在肺癌细胞中高表达^[14]，并且MLLT3/AF9基因在甲状腺乳头状癌中差异表达均与临床病理过程相关^[15]。有研究已经分析了MLL-AF9在小鼠体内模型^[16]或通过慢病毒转导MLL-AF9的靶点^[17]。反转录病毒转导细胞后，MLL-AF9的表达水平和白血病的发生呈正相关^[18]，因此推测MLLT3/AF9可能是一个促进肿瘤增殖侵袭的重要因子。

本实验通过临床资料的统计分析表明，MLLT3/AF9的阳性表达率与肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移有显著相关（P < 0.05），Real-time PCR结果显示肝癌组织中MLLT3/AF9的表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P < 0.05），提示MLLT3/AF9可能与HCC的发生发展一定的关联，再次检测肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hu7和BEL-7402中MLLT3/AF9 mRNA的表达水平，结果再次证实了上述结论，发现MLLT3/AF9在肝癌细胞中呈高表达，构建LV-MLLT3-RNAi慢病毒感染肝癌SMMC-7721细胞，在肝癌SMMC-7721细胞中下调MLLT3/AF9表达，观察对肝癌SMMC-7721细胞生物学行为的影响，Real-time PCR及Western blot的结果表明，LV-MLLT3-RNAi组中MLLT3 mRNA及蛋白表达水平明显受到抑制，CCK-8实验结果显示LV-MLLT3-RNAi组与空白对照组和阴性对照组相比较，细胞增殖能力明显下降，且具有时间依赖性，Transwell实验结果表明，LV-MLLT3-RNAi组与空白对照组和阴性对照组相比较，穿过小室的细胞数明显减少。因此，本实验可表明在体外下调MLLT3/AF9的表达可以抑制肝癌细胞增殖与侵袭，说明MLLT3/AF9与肝癌细胞的生物学行为相关。

综上所述，我们通过临床病例分析发现MLLT3/AF9的表达水平可能与肝癌患者的发生发展有关，实验结果显示MLLT3/AF9基因在人肝癌组织及肝癌细胞系中呈高表达状态，在对应癌旁组织中呈低表达状态，干扰MLLT3/AF9表达可以抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖、侵袭与迁移能力，尽管目前相关文献很少，其确切的作用机制及体内对生物学行为的影响，仍需要进一步通过实验研究予以证明，但这些结果足以证明MLLT3/AF9基因在肝癌发生发展中起着促进的作用，有可能成为新型抗肝癌药物的治疗靶点。