2018, Vol. 45文章信息
- LSD1调控Foxo3a对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响
- Effect of LSD1 on Proliferation and Metastasis of Ovarian Cancer Cells by Regulating Foxo3a
- 肿瘤防治研究, 2018, 45(8): 545-549
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2018, 45(8): 545-549
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2018.17.1548
- 收稿日期: 2017-12-05
- 修回日期: 2018-02-22
引用本文 |
2. 212000 镇江，江苏大学附属医院肿瘤科
2. Department of Oncology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, China
卵巢癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一，在妇科肿瘤中死亡率最高，高达63%[1]。晚期患者的5年生存率仅为20%[2]。因此，如何控制卵巢癌转移是肿瘤临床治疗中迫切需要解决的问题。
赖氨酸特异性去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1, LSD1）是一种黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的胺氧化酶，可特异性去除组蛋白（histones）H3上第4位（H3K4）和第9位（H3K9）赖氨酸残基上的单甲基和二甲基修饰。LSD1在细胞中发挥多种生物学功能，影响了多种肿瘤的发生和发展。在一些恶性肿瘤，如乳腺癌[3]、胃癌、神经母细胞瘤[4]、肝癌[5]、肺癌[6]、膀胱癌[7]和急性髓系白血病[8]中LSD1均高表达；近期的研究表明，LSD1在卵巢癌组织中高表达[9]。本课题组前期研究[10]表明，稳定敲低LSD1表达能够抑制卵巢癌HO8910细胞侵袭和转移，然而LSD1在卵巢癌细胞侵袭转移中的作用机制，尚不清楚。
Foxo3a是细胞内重要的转录因子，参与细胞的增殖、分化、新陈代谢等多个方面的调控[11-12]，对肿瘤细胞分化、侵袭和转移起关键性作用。Foxo3a被证实在多种肿瘤中起到抑癌基因的作用，如在乳腺癌细胞中，Foxo3a能够抑制乳腺癌细胞上皮间质转化（EMT），从而抑制细胞侵袭与迁移。
1 材料与方法 1.1 细胞和试剂诱导型稳定转染LSD1-shRNA的HO8910细胞株（HO8910-LSD1-shRNA）为本实验室保存。兔抗人LSD1购自美国Cell Signaling Technology公司，兔抗人Foxo3a购自Epitomics公司，兔抗人E-cadherin、兔抗人N-cadherin、兔抗人Snail购自Cell Signaling Technology公司，兔抗人α-tubulin单克隆抗体、羊抗兔二抗购自美国Bioworld公司；ECL显影试剂购自美国Millipore公司，聚凝胺（polybrene）、Dox和嘌呤霉素（puromycin）购自美国Sigma-Aldrich公司，LipofectAMINE2000试剂购自美国Invitrogen公司，Foxo3a过表达试剂A6730-5MG购自美国Sigma公司。PVDF膜购自美国Bio-Rad公司。
1.2 细胞培养细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素（100 u/ml）和链霉素（100 μg/ml）的DMEM培养液（均购自美国Gibco公司），环境为37℃、5%CO2的饱和湿度条件下进行培养。
1.3 蛋白质印迹法检测LSD1、Foxo3a和EMT相关基因表达将稳定沉默LSD1基因的HO8910细胞（HO8910-LSD1-shRNA）以8 000个/孔的密度接种于6孔板中，12 h细胞贴壁后，加入浓度为1、10和100 ng/ml的Dox处理（以加入1 μl/ml蒸馏水处理的细胞作为对照组）；继续培养48 h后采用蛋白质印迹法检测Foxo3a及LSD1蛋白的表达水平。用预冷的PBS洗涤细胞2次，加入100 μl含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液，置于冰上5~10 min，将裂解的细胞液转移至EP管中，每隔5 min涡旋15 s，共3次，离心机上12 000×g，4℃离心15 min，收集上清液（总蛋白）。蛋白浓度采用BCA（上海康成生物工程有限公司产品）法检测。各取50 ng蛋白，在浓度为10%的SDS-PAGE分离胶分离蛋白，然后将分离后的蛋白在300 mA恒流的条件下（1~2 h）转移至PVDF膜（美国Bio-Rad公司产品）上。PVDF膜在5%脱脂奶粉中封闭1 h，分别加入一抗为兔抗人LSD1多克隆抗体（体积稀释比为1:1 000）、兔抗人α-tubulin单克隆抗体（内参照）（体积稀释比为1:4 000）、兔抗人Foxo3a多克隆抗体（体积稀释比为1:2 000），4℃反应过夜。第二天用TBST洗膜3次，接着加入二抗[辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（体积稀释比均为1:1 000）]，室温条件下反应1 h，TBST洗膜3次，ECL显影。蛋白质印迹法检测EMT相关蛋白的表达水平，实验方法同上。一抗分别加入兔抗人LSD1多克隆抗体（体积稀释比为1:1 000）、兔抗人α-tubulin单克隆抗体（内参照）（体积稀释比为1:4 000）、兔抗人Foxo3a多克隆抗体（体积稀释比为1:2 000）、兔抗人E-cadherin抗体（体积稀释比为1:1 000）、兔抗人N-cadherin抗体（体积稀释比为1:1 000）、兔抗人Snail抗体（体积稀释比为1:1 000）。
1.4 CCK-8方法检测细胞增殖能力取对数生长期HO8910-LSD1-shRNA细胞，PBS缓冲液洗2遍，胰酶消化3~4 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液3~5 ml吹打，调整细胞密度为8×105个/毫升后将细胞接种至96孔板中，每孔种植约8 000个细胞，在37℃、5%CO2条件下培养24 h。待细胞贴壁后分别加入蒸馏水（1 μl/ml）、Dox（100 ng/ml）、A6730（20 µmol/L）、Dox（100 ng/ml）+A6730（20 µmol/L），以此分为4组，每组3个复孔。孵育（0、24、48和72 h），A6730（20 µmol/L）每天重复加一次，Dox（100 ng/ml）每两天加一次。检测前每孔加入10 µl CCK-8溶液，将培养板在37℃、5%CO2条件下孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，实验重复3次。
1.5 Transwell检测细胞迁移能力ECM胶提前一天放于4℃冰箱融化过夜。铺胶（冰上操作）：枪头在使用前需先在冰上预冷半小时，每孔加入稀释好的ECM胶30 μl，37℃、5%CO2孵育5 h。水化基底膜：吸去小室内的ECM胶，每个小室加入50 μl无血清DMEM培养液，37℃、5%CO2孵育30 min后吸去培养液。制备细胞悬液：将HO8910-LSD1-shRNA细胞用胰酶消化3~4 min，吸去胰酶，无血清DMEM悬浮，细胞调至1×105个/毫升，每孔加入150 μl细胞悬液。下室加入600 µl含10%血清的DMEM，设置4组小室，每组重复3次。待细胞贴壁后分别在4组小室中加入Dox（100 ng/ml）+A6730（20 μmol/L）、Dox（100 ng/ml）、A6730（20 µmol/L）、蒸馏水（1 μl/ml）。继续培养24 h后吸弃小室中液体，取出小室，置于500 μl 4%多聚甲醛中室温固定30 min，吸弃小室内液体，置于500 μl 0.1%结晶紫液体中室温15 min，将小室于PBS中洗数次至透明，用棉签轻轻擦掉上层未迁移的细胞，注意不要擦去下层已经迁移的细胞，在显微镜下随机选取5个视野观察细胞，计数取平均值。
1.6 统计学方法应用SPSS13.0和GraphPad Prism 5统计学软件对所有的实验数据进行统计学分析和做图整理，所有实验均独立重复3次，数据以（x±s）表示。Student t检验用于2组数据间的比较，多组间均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 干扰LSD1表达上调Foxo3a蛋白水平蛋白质印迹法结果显示，与对照组比较，观察组随Dox浓度增加LSD1蛋白水平逐渐下降，而Foxo3a蛋白表达水平逐渐增加。100 ng/ml Dox处理的细胞中LSD1表达水平下降及Foxo3a表达水平增加最显著。表明抑制LSD1表达可上调Foxo3a蛋白水平，见图 1。
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| 1: control group; 2-4: 1, 10 and 100 ng/ml Dox groups 图 1 干扰LSD1表达后Foxo3a蛋白水平变化 Figure 1 Knockdown of LSD1 upregulated Foxo3a protein levels |
CCK-8结果表明，与对照组比较，联合组、Dox组、A6730组细胞增殖率均显著下降（抑制率分别为29.8%、47.6%、36.9%），差异有统计学意义（P=0.019、0.002、0.013）。
联合组与Dox组和A6730组比较，细胞增殖率均显著下降(抑制率分别为62.5%、80.6%），差异有统计学意义（P=0.003、0.016），见表 1。
Transwell结果显示，与对照组比较，Dox组、A6730组、联合组细胞穿过小室基底膜数间差异有统计学意义（P=0.001、0.001、0.000）。此外，与Dox组和A6730组比较，联合组细胞迁移率显著降低（P=0.000、0.001）。提示LSD1通过抑制Foxo3a，增强了卵巢癌细胞的迁移能力，见表 2、图 2。
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| 图 2 Transwell实验检测四组卵巢癌细胞的迁移情况(×200) Figure 2 Metastasis of ovarian cancer cells in four groups detected by Transwell assay (×200) |
蛋白质印迹法结果显示，Dox组和A6730组与对照组相比，E-cadherin表达量增加，而N-cadherin及Snail表达量下降。此外，与Dox组或A6730组比较，联合组Foxo3a和E-cadherin表达量明显增加，而N-cadherin和Snail表达量下降。表明Foxo3a介导了LSD1对EMT标志物表达具有调节作用，见图 3。
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| 1: control group; 2: A6730 group; 3: Dox group; 4: Dox+A6730 group 图 3 Foxo3a介导LSD1对EMT相关蛋白表达的调控 Figure 3 Foxo3a mediated the regulation of LSD1 on EMT-related protein expression |
LSD1的调控涉及肿瘤的多个病理过程，在肿瘤的发生、增殖、转移和凋亡过程中都起着举足轻重的作用，并且对肿瘤细胞的维持必不可少。LSD1首先被证实与肿瘤的分化及生长有关，Schulte等[13]研究提示，LSD1与成神经细胞瘤分化密切相关，LSD1在低分化的成神经细胞瘤中高表达，实验采用siRNA干扰LSD1基因的表达后，肿瘤细胞的生长受到明显抑制；体内研究进一步证实，沉默LSD1基因的表达可以抑制成神经细胞瘤的生长。接着LSD1被证实与肿瘤的凋亡相关，Huang等[14]研究提示，LSD1的特异性抑制物能够诱导人结肠癌细胞的凋亡，并导致异常沉默的基因恢复表达。进一步LSD1被证实与肿瘤的侵袭与转移相关，Lv等[15]发现，LSD1可以促进肺癌细胞的增殖、侵袭和转移。
Fox转录因子家族的共同特征是拥有Fox（Forkhead Box）结构域，Fox是一个保守的DNA结合结构域，该结构域由3个α螺旋、3个β折叠以及2个翼状结构组成的翼螺旋结构域[16]。Fox家族成员众多，分为A-S共19个亚族，Foxo3a即属于FoxO家族。Foxo3a是研究最为完善的成员，现已发现，Foxo3a在几乎所有常见肿瘤中均表达，如肝癌[17]、肺癌[18]、胃癌[19]、前列腺癌[20]、乳腺癌[21]、淋巴瘤[22]、白血病等。如在乳腺癌细胞[23]中，Foxo3a能够抑制乳腺癌细胞上皮间质转化从而抑制细胞的侵袭与转移；同时在尿路上皮细胞肿瘤[24]中，Foxo3a下调促进TWIST1、YBX1表达增高，抑制了E-cadherin的表达从而抑制肿瘤细胞迁移。由此可见，Foxo3a调控肿瘤细胞的侵袭与转移能力在不同肿瘤中调控的结果有所不同。据此我们推测LSD1是否通过调控Foxo3a表达来调控卵巢癌细胞的侵袭与迁移。
本研究发现，抑制LSD1表达可以上调Foxo3a转录因子的表达，从而抑制卵巢癌HO8910细胞的迁移能力。有研究表明，LSD1能够通过Akt通路影响肿瘤细胞的侵袭与转移[25]，同时Akt通路能够通过促进Foxo3a从细胞核内迁移至胞质内[26]，从而抑制Foxo3a转录因子的作用。结合本研究的数据推测，LSD1可能通过Akt通路，抑制Foxo3a表达，从而促进了卵巢癌细胞的迁移。但LSD1是如何通过Akt通路调控Foxo3a的表达，以及LSD1-AKT-Foxo3a通路在卵巢癌细胞侵袭转移的作用还有待进一步研究。
综上所述，LSD1与Foxo3a对卵巢癌的发生与发展起着重要的作用，LSD1通过抑制Foxo3a表达促进卵巢癌HO8910细胞增殖与迁移，LSD1-Foxo3a通路有望为卵巢癌的治疗提供新依据。
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