0 引言

胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，占颅内原发肿瘤的60%，少突胶质细胞瘤约占胶质瘤的5%~10%^[1]，发生率仅次于星形细胞瘤，以往少突胶质细胞瘤的病理诊断主要依靠显微镜下观察组织学特点、免疫组织化学检测相关蛋白来实现，2016年WHO首次推出整合组织学表型和基因型的中枢神经系统肿瘤分类方法，并第一次以分子分型作为肿瘤分型的核心依据^[2]，染色体1p/19q联合缺失就是在这次分类中引入的重要分子参数，是少突胶质细胞瘤的诊断性分子标志物^[3]。0⁶-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（0⁶-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）是一种DNA损伤修复酶，它在胶质瘤中的表达与肿瘤耐药性相关，而MGMT基因启动子的甲基化状态是决定MGMT表达量的主要因素，并可能影响患者的化疗效果及其预后^[4]。本研究分别采用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）和巢式甲基化特异性PCR（methylation specific PCR, MSP）技术检测少突胶质细胞瘤染色体1p/19q联合缺失及MGMT基因启动子甲基化状态，分析探讨二者的相关性及临床意义，以期为胶质瘤患者的诊治提供更多理论依据。

1 资料与方法 1.1 临床资料

收集西安交通大学第一附属医院2012~2016年手术切除且组织学表型为少突胶质细胞瘤的患者共计67例，其中男40例、女27例，年龄7~81岁，平均年龄47.6岁，患者均为首发病例，且术前未进行放疗、化疗或生物治疗。根据WHO病理分级标准，诊断为WHOⅡ级少突胶质细胞瘤35例、WHOⅢ级间变型少突胶质细胞瘤32例，所有病例均经两位以上有经验的病理医师同时阅片，另选星形细胞瘤20例、瘤周正常脑组织20例作为对照。

1.2 方法

1.2.1 染色体1p/19q联合缺失检测

于光学显微镜下选择无出血及坏死的肿瘤区域，使用1p/19q双色荧光探针试剂盒（广州安必平医药科技有限公司），按说明书进行操作。在杂交区域处加入10 μl探针并盖上盖玻片，放入杂交仪，设定程序：85℃变性10 min，37℃杂交16 h；杂交完成后4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diomidino-2-phenylindole, DAPI）复染剂进行样本区复染，莱卡DM4000荧光显微镜下观察结果。结果判断：探针试剂盒中包含lp36/lq21和19q13/19p13两管探针，lp36/1q21包含红色的检测位点探针lp36和绿色的内对照探针lq21，用于检测lp36的缺失情况，19q13/19p13包含红色的检测位点探针19q13和绿色的内对照探针19p13，用于检测19q13的缺失情况，细胞核则由DAPI染成蓝色。随机计数100个肿瘤细胞核中的红色、绿色信号，当lp36/lq21比值或19q13/19p13比值< 0.80时判为lp或19q缺失。

1.2.2 MGMT基因启动子甲基化检测

用Qiagen DNA Mini Kit（51304）提取胶质瘤及对照脑组织石蜡包埋标本的基因组DNA，操作步骤按说明书进行。NanoDrop 2000C评估所提取的DNA的质量和浓度，确保DNA吸光度值A260/280均在1.8~2.0之间。用DNA甲基化修饰试剂盒（EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit，QIAGEN 59124）对上述抽提的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰，修饰后甲基化的胞嘧啶（C）保持不变，而未甲基化的C转变为尿嘧啶（U）。巢式MSP：引物序列见表 1，第一步PCR的引物为Pan-f和Pan-r，反应体系20 μl：模板DNA 0.2 μg、10 μmol/L引物各1 μl、zymoTapTMPreMix 10 μl。反应条件：95℃ 10 min，95℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环后72℃延伸10 min，4℃保存。取第一步反应产物1 μl为第二步PCR模板，第二步PCR的甲基化引物为M-f和M-r，非甲基化引物为U-f和U-r，反应体系20 μl：模板DNA 1 μl、10 μmol/L引物各1 μl、zymoTapTMPreMix 10 μl。反应条件：95℃ 5 min，95℃45 s、53℃ 45 s、72℃ 1 min，40个循环后72℃延伸10 min，4℃保存。以健康者外周血淋巴细胞（PBL）DNA作为未甲基化阳性对照，用甲基化酶（MSSsI）处理的PBL DNA作为甲基化阳性对照，蒸馏水代替模板作为空白阴性对照。PCR产物用9%聚丙酰胺凝胶电泳分离，DNA Marker 50 bp为相对分子质量标准，用AlphaImager HP荧光/可见光凝胶成像分析系统观察分析电泳结果。结果判定：电泳结果中出现非甲基条带（U）扩增，而不出现甲基化条带（M）扩增，判断为非甲基化；仅M条带或U和M条带均出现扩增，则判定为甲基化。

1.3 统计学方法

应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，采用χ²检验、Fisher精确概率法检验和Spearman等级相关分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 染色体1p/19q联合性缺失检测结果

少突胶质细胞瘤及间变型少突胶质细胞瘤组1p/19q联合缺失率均显著高于星形细胞瘤组及正常脑组织组，差异有统计学意义（P < 0.05）；而星形细胞瘤组与正常脑组织组相比差异无统计学意义（P > 0.05）；少突胶质细胞瘤（WHOⅡ级）组1p/19q联合缺失率略高于间变型少突胶质细胞瘤（WHOⅢ级）组，但差异无统计学意义（χ²=1.227, P=0.268），见图 1、表 2。提示1p/19q联合缺失与少突胶质细胞瘤的病理分级无关，而在少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤鉴别诊断中有意义。

2.2 MGMT基因启动子甲基化检测结果

少突胶质细胞瘤组、间变型少突胶质细胞瘤组、星形细胞瘤组的MGMT基因启动子甲基化率均显著高于正常脑组织组（P < 0.05），但三者组间比较差异无统计学意义（χ²=1.373, P=0.503），见表 3、图 2。

2.3 少突胶质细胞瘤1p/19q联合性缺失与MGMT基因启动子甲基化的相关性

在67例少突胶质细胞瘤中，共有43例发生MGMT启动子甲基化，其中39例（90.70%）同时发生1p/19q联合性缺失；而在未发生MGMT启动子甲基化的24例少突胶质细胞瘤中只有15例（62.5%）出现1p/19q联合性缺失，两者相比差异有统计学意义（χ²=7.831, P=0.005）。另外9例少突胶质细胞瘤未检测出1p/19q联合缺失或MGMT基因启动子甲基化。Spearman等级相关分析显示少突胶质细胞瘤1p/19q联合缺失与MGMT基因启动子甲基化呈正相关（r=0.342, P=0.005），见表 4。

2.4 少突胶质细胞瘤1p/19q联合性缺失、MGMT基因启动子甲基化与临床特征的关系

1p/19q联合性缺失率、MGMT基因启动子甲基化率与少突胶质细胞瘤患者的性别、年龄无关（P > 0.05），而与3年生存率密切相关，差异有统计学意义（P < 0.05）。生存期大于3年者的1p/19q联合性缺失率、MGMT基因启动子甲基化率均显著高于生存期小于3年者，提示二者与患者预后呈正相关，见表 5。

3 讨论

少突胶质细胞瘤是胶质瘤的一种独立类型，瘤细胞形态类似少突胶质细胞，呈圆形或多角形，排列成蜂窝状，胞核圆形、大小较一致，胞质透亮；典型病例常可见微钙化、分支状毛细血管，亦可见星形细胞瘤样成分。由于瘤细胞与周围正常脑组织没有明显界限，呈交织侵袭性生长，难以彻底切除肿瘤，因此，术后进一步化疗就显得尤为重要。但在临床实践中发现，组织学特征及WHO分级相同的个体对同一化疗方案的反应和预后不一致，从分子遗传学观点出发，胶质瘤是一类基因水平高度异质性的疾病，病理组织学形态相同的胶质瘤的分子遗传学改变不尽一致，从而导致肿瘤治疗反应和预后的差别，针对患者基因的个体差异，进行“量体裁衣”制定化疗方案，实现个体化治疗，使患者在化疗中最大获益，是未来脑胶质瘤的治疗方向^[5]。

染色体lp/19q联合缺失是指1号染色体短臂和19号染色体长臂同时缺失，Reifenberger等^[6]最早发现少突胶质细胞瘤中存在较高频率的lp/19q联合缺失。随后研究也表明，1p/19q联合缺失在少突胶质瘤中常见，发生率可达80%~90%，在间变性少突胶质细胞瘤中发生率为50%~70%，而在星形细胞瘤中发生率较低^[7]。有1p/19q联合缺失的少突胶质细胞瘤，术后复发或者进展至更高级别时，该项分子遗传学改变依然存在^[8]。据此WHO认为lp/19q联合缺失是少突胶质细胞瘤的分子特征，是其诊断性分子标志物，可用于鉴别少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤，对于治疗选择有重要意义。在本组病例中，少突胶质细胞瘤及间变型少突胶质细胞瘤中1p/19q联合性缺失率分别达85.71%、75.00%，显著高于星形细胞瘤的5.00%，与文献报道基本一致。

国外多项临床随机对照试验显示1p/19q联合缺失还是少突胶质细胞瘤化疗敏感度及预后的重要预测指标，存在1p/19q联合缺失的少突胶质细胞瘤生长速度较慢，对PCV化疗方案（甲基苄肼+洛莫司汀+长春新碱）敏感，反应率达100%，而仅有25%的无1p/19q联合缺失的肿瘤对PCV化疗方案有反应^[9]；除PCV方案外，具有1p/19q联合缺失的少突胶质细胞瘤对替莫唑胺（temozolomide, TMZ）亦有较高的反应率，Brandes等^[10]发现具有1p/19q联合缺失的间变或复发少突胶质细胞瘤中，59.4%的肿瘤对TMZ敏感。由于具有lp/19q缺失的少突胶质细胞瘤患者能够受益于PCV、TMZ化疗方案，故生存期较无缺失者显著延长^[11]。本文研究结果也显示1p/19q联合缺失率虽与少突胶质细胞瘤患者性别、年龄、病理分级无关，但与生存率密切相关，生存期大于3年者1p/19q联合性缺失率显著高于生存期小于3年者，提示1p/19q联合缺失可作为少突胶质细胞瘤患者预后因子。

MGMT是一种DNA修复酶，可以通过修复烷化剂如亚硝脲及TMZ造成的胶质瘤细胞DNA损伤，导致肿瘤耐药。而MGMT基因启动子的甲基化状态是决定MGMT表达量的主要因素，若启动子区域甲基化，则MGMT不表达或低表达，肿瘤对烷化剂敏感。由于1p/19q联合缺失的少突胶质瘤对含烷化剂的PCV化疗方案及TMZ敏感，故有部分学者猜测，这些肿瘤的化疗敏感度可能与MGMT基因启动子甲基化有关^[12]，因此本文研究了少突胶质细胞瘤1p/19q联合性缺失与MGMT基因启动子甲基化的相关性，结果显示少突胶质细胞瘤1p/19q联合性缺失与MGMT基因启动子甲基化呈正相关性，提示1p/19q联合缺失患者对化疗敏感有可能是因为同时伴有MGMT基因启动子甲基化所导致。以往研究显示1p/19q联合性缺失是少突胶质细胞瘤发生的早期事件，而MGMT启动子甲基化多发生在肿瘤进展期，因而推测二者之间可能存在因果关系^[13]，但其内在机制仍需深入探讨。进一步比较少突胶质细胞瘤、间变型少突胶质细胞瘤、星形细胞瘤的MGMT基因启动子甲基化率，结果显示各组间差异无统计学意义，提示其在鉴别少突胶质细胞瘤及星形细胞瘤中意义不大。与1p/19q联合缺失的研究结果相似，MGMT基因启动子甲基化亦与少突胶质细胞瘤患者的性别、年龄、病理分级无关，而与生存率呈正相关，提示可以用来评估预后。

综上所述，染色体1p/19q联合缺失不仅是少突胶质细胞瘤特异性分子标志物，而且与MGMT基因启动子甲基化有正相关性，检测1p/19q联合缺失在一定程度上可以估测MGMT基因启动子甲基化情况，从而提高临床病理诊断的精确性，而且对胶质瘤的治疗及预后判断具有重要的指导作用。