0 引言

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，男性及女性癌症死亡率均位于首位^[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌类型的85%，大多数在晚期确诊，预后仍待改善^[2]。免疫系统在对肿瘤的监视和清除中有着非常重要的作用^[3]，非小细胞肺癌的免疫治疗分为两大类：免疫检查点抑制剂治疗和过继性输入TCR-T（T cell receptor-T）细胞免疫疗法。T细胞活化时相应共抑制信号通路的免疫检查点（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4/programmed death 1, PD-1/programmed death ligand 1, PD-L1）的表达会增加，而免疫检查点抑制剂通过阻断上述检查点恢复或增强抗肿瘤免疫^[4]。过继性T细胞免疫疗法指对有一定识别癌细胞能力的T细胞在体外进行基因改造，提高TCR对相应肿瘤细胞抗原的特异性和亲和力，再回输体内消灭肿瘤细胞^[5]。目前细胞毒T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）抑制剂—Ipilimumab已被批准用于恶性黑色素瘤的治疗，程序细胞死亡蛋白1（PD-1）及其配体（PD-L1）抑制剂—Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab分别获得晚期NSCLC的二线治疗的适应证，Pembrolizumab更是分别凭借Keynote024和Keynote021研究获得PD-L1≥50%的晚期NSCLC和联用培美曲塞/卡铂治疗转移性非鳞非小细胞肺癌的一线治疗的适应证，2017年美国临床肿瘤学会（ASCO）上Durvalumab借PACIFIC研究证明了其是第一个在Ⅲ期NSCLC患者带来无进展生存期（PFS）显著获益的免疫检查点抑制剂^[5-11]。PD-1/PD-L1抑制剂在其他癌种如黑色素瘤、肾细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌、结直肠癌中也获得美国食品与药品管理局（FDA）的批准。免疫治疗尤其是免疫检查点抑制剂能使非小细胞肺癌的有效人群可能长期获益。但目前仍有许多问题值得探讨，如优势人群的选择、疗效的评价、治疗费用高、周期长、少见甚至罕见的严重不良反应等，因此，在免疫治疗中以恰当生物标志物筛选出优势人群至关重要，这也是免疫治疗2.0时代的含义。本文将就非小细胞肺癌免疫治疗生物标志物的研究进展作一综述。

1 PD-1/PD-L1抑制剂 1.1 单一的生物标志物

1.1.1 PD-L1

肿瘤细胞PD-L1的表达目前被认为是抗PD-1/PD-L1治疗的优势人群选择的最合理标志物，晚期肺癌的多项临床试验结果都支持肿瘤细胞PD-L1阳性表达与其疗效及预后相关，2018年ASCO发表了Pembrolizumab一线治疗PD-L1≥1%且无EGFR/ALK突变的晚期/转移性非小细胞肺癌的Keynote042研究，发现免疫治疗能显著改善PD-L1表达≥50%、≥20%和≥1%NSCLC患者的OS，分别为20、17.7和16.7月，其中≥50%疗效最显著，证实了PD-L1表达水平与Pembrolizumab一线治疗疗效的相关性。而Keynote024和Keynote 021临床试验结果均表明：在PD-L1≥50%这个特殊人群中，Pembrolizumab二线和联合化疗治疗晚期肺癌，治疗和预后获益显著优于标准二线化疗和单纯化疗^{[8, 11]}。甚至在CheckMate057研究中肿瘤细胞PD-L1表达阳性的亚组（≥1%、≥5%、≥10%），Nivolumab治疗的OS获益均比多西他赛治疗明显^[7]。而2018年ASCO上发表的IMpower131和IMpower150临床研究相关结果以及其他多项临床试验也证实了抗PD-L1药物Atezolizumab和Durvalumab免疫治疗获益程度与PD-L1表达阳性水平明显相关的观点^[12-14]。

尽管如此，CheckMate017、OAK研究都发现PD-L1表达阴性的患者也能从免疫治疗中获益^{[6, 9]}，CheckMate026的研究结果表明：在PD-L1+≥5%人群中，Nivolumab一线治疗的中位PFS并不优于标准化疗，分别为4.2月和5.9月（HR=1.15, 95%CI: 0.91~1.45, P=0.2511），故在Nivolumab一线治疗晚期NSCLC患者时，仅仅PD-L1表达阳性的患者并不一定是其疗效获益的优势人群^[15]，而2018年ASCO上发表的Pembrolizumab联合化疗对比单纯化疗用于转移性鳞癌的Keynote407研究中表明在不同PD-L1 TPS表达情况下均观察到受益，PD-L1 < 1%、1%~50%和≥50%的HR分别为0.61、0.57和0.64。

综上所述，可以发现肿瘤细胞PD-L1表达水平作为免疫治疗疗效预测的生物标志物的可靠性欠缺，造成这种现象的原因可能包括：（1）PD-L1的表达受多种机制的调控，一方面包括肿瘤细胞本身癌变过程中的信号通路，如表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase, PI3K-Akt）等通路，而另一方面炎性反应细胞因子，特别是干扰素-γ，不仅会导致肿瘤细胞PD-L1的表达，还会激发免疫微环境中其他类型细胞PD-L1的表达；（2）PD-L1可以同时表达于肿瘤细胞和免疫细胞，PD-L1检测的可能是肿瘤细胞、免疫细胞或两者共同表达的水平；（3）PD-L1的表达存在个体异质性、瘤内异质性和时间异质性，某一时间点或某一部位活检组织的PD-L1表达并不能反映其整体或长期的表达状态；（4）不同检测PD-L1表达的抗体、不同的检测平台、不同的评估体系都有其不同的阳性临界值，难以形成一个一致的标准去衡量肿瘤细胞PD-L1的表达，蓝印计划的研究结果显示：检测PD-L1表达的抗体22C3、28-8、SP263在检测率上有高度的一致性，这三种抗体及其检测平台的结果是否可以互相通用，目前仍未达成一致意见，而sp142染色阳性肿瘤细胞比其他3种抗体少，呈明显偏离状态^[16]。因此，PD-L1的表达对于NSCLC的免疫治疗疗效的预测仍然是一个不完美的标志物。

1.1.2 肿瘤突变负荷

肿瘤突变负荷（tumor mutation burden, TMB）是指肿瘤基因组中去除胚系突变后的体细胞突变的数目，基因水平变异可能导致蛋白表达发生变化，产生新抗原激发机体的免疫系统，肿瘤突变负荷一直是免疫治疗的疗效生物标记物的另一研究热点。在抗PD-1/PD-L1药物治疗肺癌的其他多项研究也都表明突变负荷高低与免疫治疗疗效相关。Keynote001研究显示：pembrolizumab在PD-L1未选择人群中，79%的高TMB的患者（> 200个非同义突变）具有持久临床获益^[17]；而Nivolumab一线治疗PD-L1阳性（≥1%）的晚期非小细胞肺癌的Ⅲ期临床试验（CheckMate026）结果也显示肿瘤突变负荷高的患者免疫治疗优于化疗，在高突变负荷的人群中，Nivolumab组和化疗组的无进展生存期分别为9.7月和5.8月；然而在OS中，两组之间没有观察到显著性差异^[15]。POPLAR研究中特别分析了血液肿瘤突变负荷（blood tumor mutation burden, bTMB）与临床获益的关系，在bTMB≥10、≥16和≥20时均可见接受Atezolizumab治疗的患者PFS和OS获益显著优于多西他赛，但在bTMB≥16时获益最大（PFS HR=0.57, OS HR=0.56）^[12]，后在Ⅲ期OAK研究中选取bTMB≥16进行确认分析，进一步验证了高血液突变负荷与Atezolizumab治疗的生存获益相关：bTMB≥16与 < 16相比，PFS的HR分别0.65 vs. 0.98^[9]。OAK研究也同时对给予组织和血浆TMB检测患者进行tTMB和bTMB的相关性分析，结果显示两者的相关性较好（相关系数为0.59，阳性一致性为64%，阴性一致性为88%）。2017年欧洲肿瘤内科学会大会（European Society for Medical Oncology, ESMO）上Foundation Medicine的一项基于血浆循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）检测结果（ALK/RET突变型和野生型），或TMB的临界值（16），分别给予突变型或高TMB患者Alectinib或Atezolizumab治疗，其结果表明：bTMB与Atezolizumab治疗疗效明显相关，因此，FDA批准血检TMB作为Atezolizumab一线治疗非小细胞肺癌的伴随诊断适应证。但是由于肿瘤的异质性、不同的临界值、不同获取样本的时间等影响因素，目前肿瘤突变负荷可能仍是一个参考的生物标志物，仍需更大的努力去探索。

1.1.3 微卫星高度不稳定性（microsatellite instability-high, MSI-H）或错配修复缺陷（deficient mismatch repair, dMMR）

当FDA批准Pembrolizumab治疗不可切除或转移性未经治疗的MSI-H或dMMR实体瘤的时候又掀起了免疫治疗肿瘤标志物的另一高潮，这是首个按照肿瘤标志物审批的泛肿瘤适应证。微卫星不稳定性是由于DNA错配修复基因（MMR）MLU1、MSH2、PMS2、MSH6等基因突变引起的，新抗原表达使其易被免疫系统所识别，增加免疫细胞浸润后免疫治疗疗效^[18]。另一方面MSI-H也可由DNA甲基化所致，如体细胞MLH1启动子过度甲基化导致MMR蛋白表达缺失，微卫星复制错误不能被纠正即发生MSI。MSI-H在肺癌中的发生率很低，2016年ASCO上报道为0.4%~0.8%。尽管在实体瘤的发生发展中MSI-H/dMMR发挥着关键的作用，但由于其在肺癌中非常少见，MSI-H/dMMR对肺癌免疫治疗疗效的预测价值有待考证，需要更多的研究和数据的支持。

1.1.4 肿瘤浸润淋巴细胞（CD8+T淋巴细胞）

有研究发现CD8+T淋巴细胞的数量是NSCLC患者免疫治疗的独立预后因素^[19]。在pembrolizumab的Ⅰ期临床试验（Keynote001）中发现治疗有效的患者基线活检标本肿瘤实质和边缘中CD8+T淋巴细胞数量高于进展的患者^[17]。因此肿瘤浸润淋巴细胞与免疫治疗疗效是有一定关联的。

1.1.5 基因突变状态

有一项meta分析比较了抗PD-1/PD-L1药物与多西他赛治疗晚期非小细胞肺癌的疗效与安全性的3项临床试验（CheckMate 057/KeyNote010/POPLAR），发现EGFR阳性人群在多西他赛组的疗效要好于抗PD-1治疗组，表明在EGFR突变患者的后线治疗中免疫治疗没有超越化疗^[20]，并且Atezolizumab一线治疗的BIRCH研究和二线治疗的OAK研究中的EGFR突变亚组分析也发现野生型的患者疗效要优于突变型^{[9, 13]}。对于出现上述结果的作用机制，有证据表明EGFR通路的激活会上调免疫微环境中PD-L1和其他免疫抑制因子的表达，使肿瘤抗原的表达和T细胞对肿瘤的浸润减少，从而促进免疫微环境的免疫抑制作用^[21]。目前，从上述多项临床试验结果可知，存在EFGR或ALK突变的患者，免疫治疗疗效及预后都不乐观，所以EGFR或ALK突变可能是免疫治疗疗效的负性生物标志物。2017年ASCO年会有研究报道除了EGFR突变和ALK融合之外，c-MET外显子14剪切突变和ROS1基因融合的人群中，TMB更低，可能与免疫治疗疗效不佳有关。然而对于有驱动基因突变的患者，免疫治疗模式仍需深思与探索。

POLD1、POLE、BRCA1、BRCA2、PRKDC、LIG3、RAD17、RAD51C、FANCF、ERCC1等少见的基因状态改变也会影响免疫治疗的疗效，它们是编码DNA复制过程中的具有校正和修复功能蛋白的相关基因，这些基因突变发生后会引起非同义突变负荷和TIL数量的升高，对免疫治疗更敏感，从而更易从免疫治疗中获益^[22-23]，已有研究表明针对POLE基因突变的子宫内膜癌、肠癌和肺癌患者使用PD-1单抗后效果显著^[24]。

另外也有报道称一些癌基因和抑癌基因通过突变或缺失等不同形式对免疫治疗产生不同程度的影响。比如抑癌基因PTEN缺失会增加肿瘤免疫抑制因子的表达，PD-1抑制剂有效率降低，这一结论在一项PD-1抑制剂的黑色素瘤研究中得到证实^[25]。另一方面有些癌基因的改变会引起免疫治疗患者疾病超进展，如癌基因MDM2/4的扩增可能引起免疫治疗后肿瘤的迅速进展，这在恶性黑色素瘤患者中获得了证实，结果表明：5例发生MDM2/4基因扩增的肿瘤患者，单独使用PD-1/PD-L1抑制剂后，短时间内（< 2月）肿瘤发生进展；8例发生EGFR基因扩增或者激活性基因突变的肿瘤患者，以及4例发生DNMT3A基因突变的肿瘤患者，同样在2月内发生了显著性进展^[26]。目前在非小细胞肺癌中，关于一些少见基因突变以及PTEN、MDM2/4等癌基因和抑癌基因的改变与PD-1/PD-L1抑制剂治疗疗效与预后之间的相关性的探索仍证据不足。

1.1.6 其他单一生物标志物

在CheckMate057、Keynote010、Keynote024的亚组分析中都发现相比抗PD-1/PD-L1治疗，无吸烟史人群化疗后获益更多，因此猜测烟草暴露或许也是疗效预测物^{[7-8, 10]}。Tumeh等发现参与肿瘤特异性免疫反应的T细胞受体簇与Pembrolizumab治疗疗效有一定关系，结果表明：相比进展组，治疗有效者在抗PD-1治疗后T细胞受体克隆较治疗前增长，但这一说法还需更充分的研究去验证^[27]。有专家提出免疫基因印迹可能是预测肺癌免疫治疗疗效的有力新指标，在黑色素瘤免疫治疗的回顾性分析中得到验证，这些基因包括编码干扰素-γ、颗粒酶A和B、穿孔素1、IDO1、LAG3和其他免疫相关基因^[28]。

1.2 联合的生物标志物

1.2.1 PD-L1表达联合其他标志物

Nivolumab一线治疗的Ⅲ期临床试验（CheckMate026）特别将肿瘤突变负荷和PD-L1表达联合进行分析，分为高TMB且PD-L1≥50%、高TMB且PD-L1表达1%~50%、低/中TMB且PD-L1≥50%、低/中TMB且PD-L1表达1%~50%四组，接受Nivolumab治疗的ORR分别为75%、32%、34%、16%，发现高突变负荷同时PD-L1表达≥50%的人群患者疗效获益更多^[15]。而在Atezolizumab的POPLAR研究中同时发现血液肿瘤突变负荷≥16与肿瘤细胞PD-L1表达≥50%之间只有有限的重叠（P=0.62），两者分别互占19.2%和29.1%的比例^[12]，与疗效的相关分析显示bTMB≥16且PD-L1表达≥50%或免疫细胞≥10%的患者从Atezolizumab治疗中获益最大。

最近，关于PD-L1联合CD8+TIL对免疫治疗的预测价值的探讨和研究逐渐增多，有研究将免疫微环境中的PD-L1与TIL分为四种存在状态：Ⅰ型（TIL+/PD-L1+）、Ⅱ型（TIL-/PD-L1-）、Ⅲ型（TIL+/PD-L1-）、Ⅳ型（TIL-/PD-L1+）^[29]，而在另一研究基于上述四分法评估PD-L1联合CD8+T淋巴细胞对Ⅲ期NSCLC的预测作用，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型患者的PFS分别为17.6月、13.1月、未达到（no reach, NR）和8.6月（P=0.02），OS分别为35.3月、36.9月、NR和13.9月（P=0.11），结果表明CD8+T淋巴细胞高的患者PFS和OS都明显延长，但也发现PD-L1阴性的患者生存更好^[30]。故两种生物标志物对免疫治疗的联合预测有一定价值。

1.2.2 肿瘤突变负荷联合其他标志物

2016年ASCO上有报道称：5 895例肺癌患者之中的22例（0.4%）MSI-H，有21例患者的肿瘤突变负荷增高，因此显示MSI-H/dMMR患者肿瘤突变负荷可能增高。CheckMate026分析了不同吸烟状态下肿瘤突变负荷的情况，结果表明目前吸烟和曾经吸烟人群的TMB比从不吸烟人群的TMB要高^[15]。

1.2.3 鼠类肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS）或肿瘤抑制蛋白TP53突变联合其他标志物

有研究发现TP53或KRAS基因突变会导致PD-L1的表达和CD8+T细胞浸润都会增加，当两者同时突变时PD-L1的表达会更显著，肿瘤突变负荷往往是高的，Pembrolizumab治疗的临床获益也往往较好，所以，KRAS或TP53突变联合PD-L1或CD8+T细胞的预测价值可能较好^[31]。Atezolizumab的BIRCH研究中一线治疗的KRAS突变亚组分析发现突变型的患者疗效要优于野生型，无进展生存期分别为9.8月 vs. 7.1月，中位总生存期分别为31.9月 vs. 21.3月^[13]。2017年世界肺癌大会（World Conference on Lung Cancer, WCLC）上报道了一项评估KRAS合并其他突变对免疫治疗疗效的影响的研究，分析了KRAS合并LKB1（liver kinase B1）突变（KL型）、KRAS合并TP53突变（KP型）、仅KRAS突变（K型）这三个人群的生存，发现KP型患者的有效率最高，KL型患者的有效率最差，KL型、KP型和K型的客观缓解率分别为7.4% vs. 35.7% vs. 28.6%（P=0.00073），中位总生存期分别为6.4月vs. 16.0月vs. 16.1月（P=0.0018），无疾病进展期分别为1.8月vs. 3.0月vs. 2.7月（P=0.0045），因此表明相比其他两型，KRAS联合TP53突变的临床疗效是最好的，与此同时，该研究也发现丝氨酸-苏氨酸激酶11（serine-threonine kinase, STK11）突变的肺癌中，TMB更高，但PD-L1表达更低，这似乎提示了KL型患者的PD-L1抑制剂治疗疗效差的原因，但是具体机制尚不明确。对于存在TP53或KRAS突变的肺癌患者，目前没有靶向药物可以应对这两个比较高频的基因突变，免疫治疗给这部分患者带来了治疗的曙光。

1.2.4 其他联合生物标志物

Teff基因标签是指PD-L1、IFNG、CXCL9这3个基因的mRNA表达水平，Teff基因标签与PD-L1的免疫组织化学有一定的重叠，也代表了一类特殊的PD-L1亚型。2017年WCLC发表：在OAK研究中Teff高表达的患者PFS和OS获益更明显，Teff≥50%和 < 50%两组无进展生存期的HR分别为0.73 vs. 1.30，中位总生存期的HR分别为0.59 vs. 0.87，同时也发现了Teff基因标签的预测免疫治疗生存的价值优于PD-L1 IHC。目前只有少许研究证明了Teff基因标签的预测价值，希望今后更多的研究能奠定它的地位。

2 CTLA-4抑制剂

现阶段抗CTLA-4药物治疗在非小细胞肺癌中的应用主要是与化疗或PD-1/PD-L1抑制剂联合治疗，最近一项Ipililumab联合Nivolumab一线治疗无EGFR突变和ALK融合、TMB≥10 mut/mb的晚期非小细胞肺癌患者的Ⅲ期临床试验CheckMate227结果显示对比一线化疗，高肿瘤突变负荷患者联合治疗的PFS得到明显改善，预示着TMB可以成为免疫治疗的一个重要的独立预测的生物标志物，可鉴别出可能从Ipililumab联合Nivolumab治疗中获益的一线NSCLC患者^[32]。同时在临床试验CheckMate012和CheckMate032中也证明了Ipililumab联合Nivolumab治疗疗效与PD-L1表达水平相关，但不良反应也增加^[33-34]。而目前CTLA-4抑制剂中仅有Ipilimumab被FDA批准治疗恶性黑色素瘤，故抗CTLA-4治疗疗效及毒性的生物标志物的探索大多在黑色素瘤患者中进行。多项研究表明肿瘤浸润淋巴细胞、调节性T细胞、髓样抑制细胞的计数、各种细胞因子/趋化因子（IFN-γ、IL-18、IL-17等）、乳酸脱氢酶和IDO（吲哚胺-2，3-双加氧酶）等与Ipilimumab治疗黑色素瘤的疗效有很大的相关性^[35]，因此猜想这些生物标志物对非小细胞肺癌CTLA-4抑制剂免疫治疗的疗效或许有一定预测作用，但是仍需要前瞻性临床研究去阐明和验证这些生物标志物对肺癌免疫治疗的指导作用。综上所述，在非小细胞肺癌中明确探讨预测CTLA-4抑制剂治疗疗效或不良反应的生物标志物的相关研究仍明显不够，探索仍任重道远。

3 TCR免疫治疗

过继性TCR-T细胞免疫治疗方法是通过基因改造的手段提高T细胞受体对特异性肿瘤抗原的识别能力和进攻能力，经T细胞受体转导的T细胞可以靶向大部分的肿瘤特异性抗原^[36]。目前在肺癌中通过T细胞改造所靶向的肿瘤相关抗原包括：NYESO-1，一种睾丸肿瘤抗原，在高达30%肺癌患者中可见；VEGF-2，在多数肺癌患者中表达；MAGE-A3，在高达40%肺癌患者可见；其他肿瘤相关抗原。这种疗法已经在黑色素瘤和白血病中被证明有明显和持续的作用，然而在除黑色素瘤的其他实体瘤中仍然面临巨大的挑战，目前暂无TCR-T疗法治疗肺癌出现临床获益的相关报道发表。有研究表明肿瘤微环境相关因素，如肿瘤相关基质成分和免疫微环境相关因素，如特异性肿瘤相关抗原的表达与脱落、T细胞的生存/持续时间、抑制性免疫细胞和分子的出现等因素可能与TCR-T治疗的疗效及不良反应相关^[37]，这些影响因素仍然需要大量基础研究和临床试验来深入探索和验证。

4 总结

众所周知，目前免疫治疗主要包括三大类：PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂和TCR治疗，免疫治疗重塑了目前肺癌领域的治疗模式，最近免疫检查点抑制剂临床试验证明了免疫治疗能提高PD-L1阳性的晚期肺癌的生存，并且以低不良反应率在肺癌治疗中取得巨大进展。随着对免疫系统、免疫微环境和多种肿瘤逃避免疫系统机制的认识加深，通过干扰或阻断这些机制来治疗肿瘤的方式虽然给肺癌患者带来很多的机遇，但是大部分患者对免疫检查点治疗仍不敏感，需要合理的标志物去发现优势人群。目前最可靠的标志物是肿瘤细胞PD-L1的表达，但也有不足之处。而关于免疫治疗疗效、预后和不良反应的生物标志物的各项研究正在进行中。另一方面，有学者将肿瘤免疫表型分为免疫沙漠型、免疫排除型和炎症型3种类型，未来或许可从肿瘤免疫表型出发探索更好的生物标志物筛选优势人群及预测疗效。随着肺癌各种治疗方式的发展，相信免疫治疗将引领非小细胞肺癌诊疗进入更精准有效的治疗时代，给肺癌患者带来更多的获益。