0 引言

癌症是威胁人类生命健康重大的疾病之一，而转移是导致癌症死亡最主要的原因^[1-3]。预防或减少转移并因此提高生存率是实体肿瘤治疗最重要的目标之一。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）是指从原发肿瘤脱落，在血液和淋巴管中循环到远处器官定植的肿瘤细胞，负责转移的开始和将癌症传播到远处^[4-6]。CTCs可用于癌症诊断和癌症状态的监测，是追踪肿瘤细胞转移的关键。早期肿瘤患者采用手术切除后虽然对局部确诊的疾病看似具有“治愈性”，但是在5年内超过50%的患者会发生复发与转移^[3]，主要原因在于患者外周血中已经存在CTCs，而这部分CTCs不能被影像学检测到。临床研究证明，CTCs与多种癌症如乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的疾病进展相关^[7-9]。因此，在实体瘤患者的复发和生存上CTCs是有用的预后和预测标志物^[10]。

虽然CTCs计数对癌症的早期诊断和临床治疗具有很大的指导价值，在检测方面却面临诸多困难与挑战。首先，外周血中的CTCs数目极为稀少（每毫升血约含有1~100个CTCs），这要求所用检测方法能高效准确地从大量非目标细胞中检测出极少的目标细胞^[11]。其次，研究表明CTCs具有较大的异质性，因为进入外周血的CTCs已发生部分或完全的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）^[12-13]，而当前的检测方法几乎不能区分CTCs亚群之间的差异，也不能明确具有形成微转移和转移能力的CTCs来自哪一个亚群。因此，对CTC亚群的研究可能为抗癌研究开辟新的途径。最后，由于外周循环的剪切力、免疫系统攻击以及细胞附着和细胞-基质连接丧失，导致血液中的大部分CTCs处于凋亡状态，仅有一小部分具有高度活性与转移潜能的CTCs能够在血液循环中生存并发生远端器官的转移^[14]。这一部分极可能是真正具有临床意义、对治疗具有重要价值的CTCs。因此，急需发展高捕获率、高纯度和高通量的分离检测技术，从而能够满足科研和临床需求。

1 CTCs体外培养的重要性

近年来CTCs检测技术不断发展，由于不同的富集和检测方法，在临床实践中CTCs的检测方法尚未标准化，其主要应用仍局限于简单的计数^[15-16]。值得注意的是，针对CTCs进行简单的计数对提高癌症个体化治疗的发展可能并没有显著的贡献。有研究指出肿瘤患者治疗后CTCs数量的增加并不能区分是死的还是活的CTCs，因此，在临床治疗指导上可能会出现偏差^[17]。而死亡和有活性的CTCs的比值可能在临床实践中更重要，例如，该比例的增加可能表明成功的治疗结果^[17-18]。在辅助治疗后，除了对CTCs进行计数以外，监测死亡与存活的CTCs比值可为临床提供相关信息^[17]。鉴于CTCs被认为是评估患者治疗反应和预后的潜在标志物，Khoo等采用低吸附的60 mm培养皿，在37℃、5%CO₂、1%O₂（缺氧条件）的培养箱中培养CTCs集落形成实验作为治疗反应的预测指标，发现经较长时间全身治疗后的患者血液样本中，CTCs集落形成逐渐减少。此外，还发现治疗后的样本集落形成能力与早期疾病进展和较短的总生存期相关^[19]。

此外，对原发性肿瘤、CTCs和转移灶进行基因表达谱的比较，可能揭示肿瘤进展、肿瘤复发和转移发展的细胞变化，导致上述现象的分子事件可以基于CTCs进行分析研究。然而，由于CTCs数量稀少，在基因组和蛋白质组学分析之前必须对其先进行富集。由于不能收集足够数量的细胞，它们的生物学和临床意义受到限制，而对极少数目的CTCs实现体外培养将可突破这一瓶颈。目前，体外成功培养建系的CTCs文献报道非常有限，仅有结直肠癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌的CTCs细胞系被建立，其主要通过微流控芯片（microfluidic chip）、荧光激活细胞分选（fluorescence activated cell sorting, FACS）和阴性富集等方法预先富集得到^[20-24]。

CTCs的体外扩增可以让我们了解其多方面的表型，其中包括从癌症患者分离得到CTCs并进行体外培养，然后可研究化疗药物和抗体药物的体外药效。此外，还可将体外扩增不同表型的CTCs通过尾静脉注射到免疫缺陷小鼠体内，将能够回答哪些表型的CTCs是发生转移所必须的，其中一个答案可能是那些获得干细胞样特征的CTCs，具有引起微转移或转移的潜力^[25]。最近，已有报道表明一些CTCs或CTCs亚群具有干细胞样特征，类似的问题可以通过CTCs体外培养来解决^[26-27]。

2 CTCs体外培养方法与条件

虽然CTCs的体外培养可用于治疗反应的早期预测以及对临床肿瘤治疗具有重要的指导价值，但在体外培养上却面临诸多困难与挑战，其原因在于大多数方法在样本前处理、富集分选过程以及培养条件不当等都会对CTCs造成不可逆的损伤。首先CTCs体外培养应确保整个富集分选过程中对CTCs的损伤尽量小；其次富集后能将CTCs浓缩，提高肿瘤细胞密度和培养成功率；最后，需营造一个有利于CTCs体外增殖的培养环境，包括物理环境（如缺氧条件、三维培养支架）、化学环境（如合理的培养基、生长因子等）和生物环境（辅助培养的细胞）等。

Kolostova等采用基于尺寸的膜分离技术富集膀胱癌患者外周血中的CTCs，将富集于膜上的CTCs转移到6孔板内，添加4 ml的含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在标准的癌细胞培养条件下（37℃、5%CO₂）体外培养CTCs^[28]。该研究在培养第10至14天后即进行下游的实验分析，但是并未建立循环肿瘤细胞系。Zhang等采用基于免疫亲和性的微流体装置捕获早期肺癌患者CTCs，然后在芯片上直接培养。为了促进CTCs扩增，Zhang等测试了四种不同的培养环境来明确CTCs的最佳生长条件，分别为2D、3D培养，以及是否添加肿瘤相关成纤维细胞，结果发现引入肿瘤相关成纤维细胞后可明显促进CTCs的增殖，而在3D培养条件下其增殖倍数最大，这种环境可能在促进CTCs增殖和存活方面发挥关键作用^[29]。

Yu等采用CTCs微流体技术（CTCs-chip）分离培养乳腺癌患者的CTCs，发现在无血清培养基中添加表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF），并在低氧环境培养（4%O₂），可以使CTCs以球状良好扩增^[21]。Zhang等也采用CTCs-chip用于捕获肝癌CTCs，并将CTCs置于3D培养的微环境中，添加10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养^[30]。与此类似，我们课题组也采用CTCs-chip技术对肺癌患者的CTCs进行富集分选，然后将得到的CTCs加入低吸附的96孔板中，并添加RPMI 1640培养基（含20 ng/ml上皮生长因子EGF，20 ng/ml碱性纤维生长因子FGF2，B27添加剂及1%的抗生素）于37℃、5%CO₂、3%O₂的培养箱中培养，待CTCs开始增殖时转至正常氧气浓度下培养，最终获得肺癌循环肿瘤细胞系^[22-23]。以上研究表明非贴壁的培养条件和低氧环境对于CTCs的体外培养至关重要。

3 CTCs体外培养的应用

从血液中富集分选后得到具有活性的CTCs，如果能够成功地在体外培养、增殖，获得足够的数量，那么将能够对其进行全面的分子与功能研究，如对肿瘤细胞与正常细胞物理特性差异的研究；对原发性肿瘤、CTCs和转移灶进行基因表达谱的比较；对CTCs不同表面标志物表达的研究；对CTCs进行药物敏感度实验和建立动物转移模型等。这将有利于肿瘤患者早期诊断、辅助临床进行精确治疗、术后肿瘤复发与转移及预后评估等。

针对CTCs进行单细胞测序或全基因组测序已有大量研究，Schölch等通过对结直肠癌CTCs的基因表达谱分析发现大多数的CTCs处于休眠状态，并具有免疫逃逸的表型^[25]。这或许可以解释免疫系统未能有效地从血液中清除CTCs，以及CTCs对于细胞毒性治疗具有抵抗性的机制。Jiang等对晚期前列腺癌患者的原发瘤、癌旁组织和CTCs进行单细胞全基因组测序研究，发现与原发性和转移性肿瘤相比，CTCs的外显子等位基因突变更加频繁，而且CTCs存在更广泛的异质性^[31]。癌症基因组不稳定性已被认为是肿瘤个性化治疗的潜在障碍，因为它与治疗性耐药有关，这可解释肿瘤临床靶向治疗容易造成耐药的原因。

体外培养的CTCs除了用于测序之外，还可进行药物敏感度实验，而且使用CTCs要比原发性肿瘤细胞更有利，因为CTCs负责转移的开始和将癌症传播到远处，而干预转移是提高疗效的关键，但由于长时间培养和多次传代有可能导致CTCs在表观遗传学和基因表达方面不再代表原始肿瘤的表型。因此，还有待进一步深入研究。Yu等从乳腺癌患者外周血中分离CTCs，并通过体外培养建立了细胞系。动物实验研究发现5株CTCs细胞系中有3株在小鼠上具有致瘤性。基因测序显示CTCs存在PIK3CA基因突变和新获得的突变基因ESR1和FGFR2。而药物敏感度实验发现CTCs对紫杉醇和卡培他滨敏感，对氟维司群、阿霉素和奥拉帕尼耐药^[21]。此外，Zhang等利用3D培养技术对肝癌CTCs进行药物敏感度检测，发现用索拉菲尼和奥沙利铂处理CTCs后可显著抑制克隆球的形成^[30]。与以上研究不同的是，Hughes等对7例癌症患者（乳腺癌3例、前列腺癌2例、结直肠癌1例、肾癌1例）原始血液样本中的CTCs进行了药敏研究，用阿霉素和多西紫杉醇处理后发现有3例CTCs（2例乳腺癌、1例前列腺癌）对双药都敏感，另外3例CTCs（1例结直肠癌、1例肾癌、1例乳腺癌）只对单药敏感，剩余1例前列腺癌均不敏感^[32]。

除此之外，CTCs体外培养还可用于研究肿瘤转移机制。Aceto等研究发现CTCs细胞簇是由单克隆肿瘤细胞形成而不是在血液循环中聚集形成，而且血液中的CTCs细胞簇相对单个CTCs而言较为稀少，但其形成转移的潜能是单个CTCs的20~50倍^[33]。而Au等研究发现CTCs细胞簇能够迅速的重组成可逆性单细胞链状结构，降低其流体动力学阻力，从而穿过毛细血管大小的体内血管^[34]。这些研究结果表明，CTCs细胞簇可能比之前认为的肿瘤传播发挥更大的作用，并有可能针对引发转移的CTCs细胞簇制定治疗策略。

4 展望

综上所述，鉴于循环肿瘤细胞在肿瘤早期诊断、复发和转移监控、疗效预测和评价方面的重要价值，已经成为液体活检领域的研究热点。转移是导致肿瘤患者死亡的主要临床事件，积极干预转移是改善肿瘤患者整体生存的关键^[35]，而积极干预处于循环系统中的CTCs是预防转移的重要一环。未来该领域首先要从循环系统中分布的肿瘤细胞进行筛选鉴别出真正导致转移的CTCs亚群的分子特征，并将该细胞群纳入肿瘤风险评估模型的构建，以弥补现有临床分析体系的不足。其次，可考虑分离培养该CTCs亚群，并以之作为药物筛选的体外平台^[36]，通过构建CTCs与免疫细胞以及其它血细胞的共培养体系，进一步研究CTCs在血液中的存活机制，从而开发新的干预策略。因为CTCs是稀有细胞，需要开发一种易于操作且可靠的方法，可以高效富集和鉴定这些CTCs。这些措施的顺利实施将有助于推动CTCs作为“液体活检”的重要工具而临床快速推广。