0 引言

HPV感染是宫颈癌的主要病因之一，而HPV16-E6是主要癌蛋白，可通过某些途径如E6-AP-P53途径抑制P53的表达，从而抑制细胞凋亡，与宫颈癌发生发展相关^[1-3]。巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）是一个具有多效炎性介质功能的细胞因子，与肿瘤的侵袭转移有关，可通过COX-2、Jab1和NO途径拮抗p53的功能，抑制癌细胞的凋亡，促进其侵袭转移^[4-6]。HPV16-E6蛋白是否可通过诱导MIF表达，从而通过COX-2、Jab1和NO途径拮抗p53的功能尚未见报道。本研究通过体外实验检测HPV16-E6蛋白与MIF表达的关系，分析HPV16-E6是否能通过MIF影响宫颈癌细胞的增殖和凋亡，从而找到更多可用于评估病情和预后的相关分子标志物。同时分析MIF和HPV16-E6蛋白组织标本表达的相关关系，探索HPV16-E6是否可以通过MIF影响宫颈癌患者的预后。

1 材料与方法 1.1 标本来源

石蜡标本选取2007年1月至2008年12月在武汉大学中南医院妇瘤科住院患者手术切除的经病理学确诊为宫颈癌的标本56例，术前均未进行过放化疗，随访资料完整。年龄27~64岁，中位年龄45岁，分期为ⅠB至ⅡB期，其中，48例为鳞状细胞癌，5例为腺癌，3例为腺鳞癌。另外，收集8对新鲜宫颈癌和癌旁正常组织用于提取RNA。标本采集均经过患者家属签署知情同意书并经本医院伦理委员会审核通过。采集后的标本行石蜡标本切片。

1.2 材料

人宫颈癌C33A、Siha和Caski细胞为本实验室保存，人单核细胞THP-1为武汉大学中南医院医学科学研究中心提供；RPMI 1640培养液、胎牛血清（Hyclone公司，美国）；TRIzol、RNA反转录和实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；PCR引物由生工生物工程有限公司合成；shE6质粒由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成；E6过表达载体由武汉百翼生物设计并合成；zlip2000（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；细胞周期、凋亡试剂盒（BD Bioscience Pharmingen公司，加拿大）；鼠抗人HPV16-E6抗体及二抗（Abcam公司，美国）；鼠抗人β-actin、鼠抗人GAPDH、兔抗人MIF抗体（Affinity公司，美国）；人MIF Elisa试剂盒（博士德生物工程有限公司）；PMA、4-IPP（Sigma公司，美国）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养、传代和转染

用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养C33A、SiHa、Caski和THP-1细胞，于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养。每2~3天换一次液，倒置荧光显微镜下观察，待细胞融合至80%~90%时进行传代。根据Genbank搜索的HPV16-E6基因序列（GI编号：1489078）由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成2条shRNA，两条shRNA作用于HPV16-E6基因的靶点序列分别为：CGGCATTTATGCATAGTATAT和GCTGCAAACAACTATACATGA。以pGPH1/GFP/Neo-载体构建重组质粒sh1和sh2，并用pGPH1/GFP/Neo-shGAPDH作阴性对照。用脂质体zlip2000和shGAPDH、sh1、sh2质粒分别转染SiHa和Caski细胞，同样的方法用PLV-EGFP-N-HPV16-E6、PLV-EGFP-N质粒转染C33A细胞。实验分组为：对照组SiHa/Caski-NC，干扰实验组SiHa/Caski-sh1、SiHa/Caski-sh2；对照组C33A-NC，实验组C33A-E6。

1.3.2 巨噬细胞诱导和共培养

用100 ng/ml PMA诱导接种于6孔板的人单核细胞THP-1 48 h，显微镜下观察大多数细胞贴壁，伸出伪足，核质比降低，即诱导为巨噬细胞^[7-9]。将宫颈癌细胞接种于0.4 μm Transwell小室中，对照1.3.1方法进行SiHa和C33A细胞转染，转染24 h后将培养宫颈癌细胞的Transwell小室放入6孔板与巨噬细胞继续非接触性共培养24 h，提取6孔板中巨噬细胞总RNA和蛋白。

1.3.3 实时荧光定量PCR

用TRIzol试剂提取细胞和组织总RNA，cDNA的合成按RT试剂盒说明书操作。设计并合成HPV16-E6和MIF的引物，以18s作为内参，然后按TaKaRa Taq酶推荐的PCR反应体系进行荧光定量PCR实验。结果首先计算各样本测定基因X的Ct与内对照基因18s Ct的差值，即ΔCt=Ct（X）-Ct（18s），再用各实验组样本的ΔCt减去对照组样本的ΔCt，得到ΔΔCt，利用2^-ΔΔCt进行计算，表示实验组与对照组目的基因的相对表达量。

1.3.4 Western blot法检测蛋白表达

收集细胞，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白，进行15% tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分离；然后湿法将蛋白转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭，一抗孵育4℃过夜，二抗室温1.5 h，用ECL化学发光液进行显影，以β-actin作为内参，应用Image Lab软件进行灰度值分析，以目的蛋白和内参蛋白的灰度值之比表示蛋白相对表达量。

1.3.5 Elisa法检测细胞上清液中MIF蛋白表达量

收集对照组细胞和转染组细胞上清液，离心后备用。按Elisa试剂盒说明书操作，多功能酶标仪测量吸光度。以标准孔作标准曲线，根据待测样品吸光度计算出上清液中MIF蛋白表达量。

1.3.6 CCK-8法检测细胞增殖

实验分为对照组C33A-NC，实验组C33A-E6和C33A-E6-IPP（转染24 h后加MIF抑制剂4-IPP 50 nmol/ml），设3副孔，培养48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，避光孵育2 h，450 nm波长下测定吸光度值A。

1.3.7 细胞周期和凋亡检测

将胰酶消化后离心获取的转染后48 h的各组细胞离心去上清液，将细胞重新悬浮于70%预冷乙醇中，4℃固定至少24 h。检测前离心去上清液，PBS冲洗细胞两次，加RNA酶孵育20 min，标本置于冰上终止RNA酶活性，加碘化丙啶溶液4℃避光染色30 min，400目筛网过滤后行细胞周期检测。细胞凋亡检测采用Annexin V-FITC/PI试剂盒。消化的细胞离心后用400 μl预冷的PBS重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC，室温下避光孵育15 min。随后加入10 μl PI染液，轻轻混匀后避光孵育5 min，上机检测细胞凋亡情况。

1.3.8 免疫组织化学染色及评分

采用链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶染色法（SP法），组织芯片切片经常规脱蜡后，微波修复抗原，用3%过氧化氢去离子水封闭10 min。一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育30 min，DAB染色后苏木精对比染色，封片。用组织芯片扫描仪（型号Pannoramic MIDI，3D HISTECH）扫描免疫组织化学染色结果。400倍镜下每个点任选5个视野，3分为强阳性（深棕色），2分为中度阳性（棕黄色），1分为弱阳性（浅黄色），0分为阴性（蓝色细胞核）。用Image Pro-plus6.0软件分析各染色强度细胞阳性率，则每100个细胞中阳性细胞数为N。染色强度与阳性细胞数N相乘所得即为积分H-score=(1×N1)+(2×N2)+(3×N3)。以H-score=50作为截断值，H-score≤50定义为低表达组，H-score > 50定义为高表达组。

1.4 统计学方法

本实验数据用SPSS19.0软件包进行统计，组间比较采用t检验和单因素方差分析，率的组间比较用χ²检验，HPV16-E6表达情况与生存率比较采用Kaplan-Meier法，并用Log rank检验进行组间比较，计量变量之间相关性分析采用Pearson相关分析。以α=0.05（双侧）作为校检标准，P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 HPV16-E6过表达和干扰效果鉴定

用成功构建的pGPH1/GFP/Neo-sh1和sh2质粒转染HPV16阳性细胞系SiHa和Caski，SiHa细胞实验组E6 mRNA表达量0.26±0.06和0.38±0.06明显低于阴性对照组1.05±0.05（t=10.61, P < 0.01; t=8.06, P < 0.01）；Caski细胞实验组E6 mRNA表达量0.07±0.001和0.37±0.04也明显低于阴性对照组0.88±0.09（t=5.22, P < 0.01; t=9.15, P < 0.001），说明干扰作用有效，且两组细胞sh1干扰效率均高于sh2。PLV-EGFP-N-HPV16-E6成功转染HPV阴性细胞系C33A后，实验组E6 mRNA表达量0.82±0.09明显高于阴性对照组0±0（t=9.09, P < 0.001），说明过表达作用有效，见图 1。

2.2 HPV16-E6可诱导宫颈癌细胞表达和分泌MIF

C33A细胞应用HPV16-E6过表达质粒能显著上调实验组MIF mRNA（t=7.45, P < 0.01）和蛋白表达。HPV16阳性细胞SiHa应用特异性HPV16-E6干扰质粒sh1和sh2后，MIF mRNA（t=16.77, P < 0.001; t=8.64, P=0.001）和蛋白表达明显下调，同样，HPV16阳性细胞Caski应用shRNA后MIF mRNA（t=3.61, P < 0.05; t=8.79, P < 0.01）和蛋白表达明显下调，见图 2。同时，HPV16-E6过表达或干扰后，细胞培养上清液中MIF蛋白量发生明显上调或下调，HPV16-E6可诱导MIF蛋白分泌，见图 3。

2.3 HPV16-E6可诱导宫颈癌微环境中巨噬细胞MIF表达

用宫颈癌细胞SiHa、C33A与巨噬细胞共培养模拟宫颈癌的部分微环境，结果显示，与单纯培养巨噬细胞相比，和C33A-NC及SiHa-NC共培养的巨噬细胞内MIF mRNA和蛋白表达量均明显升高。和HPV16-E6过表达C33A细胞共培养后，模拟宫颈癌微环境中巨噬细胞MIF mRNA和蛋白表达量均明显升高，同时，和HPV16-E6干扰后SiHa细胞共培养后，模拟宫颈癌微环境中巨噬细胞MIF mRNA和蛋白表达量均明显降低（F=74.89, P < 0.0001），见图 4。

2.4 HPV16-E6对宫颈癌细胞增殖、周期和凋亡的影响

C33A转染HPV16-E6后，细胞增殖活性（1.86±0.04）明显高于阴性对照组（1.12±0.12），加MIF抑制剂4-IPP后的过表达组（1.53±0.05）相比单纯过表达组细胞增殖活性明显降低（F=23.04, P < 0.01）。周期检测结果显示C33A转染组细胞G₀/G₁期比例与对照组相比明显下降，而转染后加抑制剂组细胞G₀/G₁期比例相比单纯过表达组明显增加（P < 0.05），见表 1。流式细胞凋亡检测结果显示，C33A转染组细胞凋亡率（5.93±1.33）明显低于对照组（19.03±0.76），加4-IPP后的过表达组细胞凋亡率（13.50±0.96）明显增加（F=39.75, P < 0.001），见图 5。

2.5 HPV16-E6通过MIF影响宫颈癌患者的生存率

检测的8对组织中，癌组织中HPV16-E6和MIF mRNA表达均显著高于癌旁正常组织，每对样本表达量t检验均P < 0.05，差异有统计学意义。免疫组织化学染色结果显示，HPV16-E6和MIF表达均常见于细胞质中，且对应的组织芯片点二者表达高低有相似性，见图 6A。对免疫组织化学H-score评分进行Pearson相关分析，结果表明MIF表达与HPV16-E6表达成中度正相关（R=0.66, P < 0.0001），见图 6B。

HPV16-E6表达在患者年龄、肿瘤大小、分期和有无淋巴结转移组间比较差异无明显统计学意义（均P > 0.05），见表 2。Kaplan-Meier法生存分析显示，HPV16-E6高表达组患者的总生存和无进展生存时间明显短于HPV16-E6低表达组，差异有统计学意义（Log rank χ²=4.49, P < 0.05; Log rank χ²=6.17, P < 0.05），见图 7。

3 讨论

HPV与宫颈癌之间的病因学关系已经很明确，有早期研究表明，HPV16阳性提示预后不良，主要与组织学特征如鳞状细胞癌、细胞增殖和侵袭等相关^[10]。E6是HPV促进宿主细胞增殖以促进病毒扩增的主要致癌基因，HPV16-E6可通过E6AP和p53的复合物结合而使肿瘤抑制因子p53失活，从而促进肿瘤进展。MIF是一类具有独特结构的多效免疫调节细胞因子，具有类似趋化因子的功能。MIF可通过与P53相互作用、基因应激或促进慢性炎性反应来防止细胞凋亡促进癌发展^[5]。本研究用HPV16-E6过表达质粒转染HPV16阴性宫颈癌细胞系C33A，用HPV16-E6干扰质粒转染HPV16阳性宫颈癌细胞系SiHa和Caski，3种宫颈癌细胞都表现出随HPV16-E6增加MIF表达和分泌增加的特点。因此，HPV16-E6能上调宫颈癌细胞MIF表达和分泌。

Krockenberger等^[11]研究显示宫颈癌组织中MIF表达水平明显高于正常组织。而本研究所取8对新鲜组织中，宫颈癌组织HPV16-E6和MIF mRNA表达显著均高于癌旁正常组织，与其他研究结果一致。本实验56例患者生存分析表明HPV16-E6表达增高可降低患者总生存率和无进展生存率，提示预后不良。Chang等^[12]研究表明，MIF高表达可显著降低宫颈癌患者总生存率和无进展生存率。同时，本研究细胞实验证明了HPV16-E6能上调宫颈癌细胞MIF表达，免疫组织化学评分相关分析提示HPV16-E6和MIF呈正相关（P < 0.05），结果有统计学意义。因此，我们认为HPV16-E6通过诱导MIF来影响宫颈癌患者的预后。

同时，肿瘤微环境由恶性细胞和肿瘤相关基质组成，巨噬细胞是微环境中一种重要的免疫细胞，本研究结果发现HPV16-E6可以诱导宫颈癌微环境中巨噬细胞MIF的表达。宫颈癌细胞HPV16-E6促进MIF表达，MIF可通过激活MAPK/PI3K/Akt通路刺激肿瘤细胞增殖，抑制p53依赖性凋亡，增加血管内皮生长因子（VEGF）的产生，抑制抗肿瘤免疫应答^[13-14]。肿瘤细胞分泌MIF可以诱导肿瘤相关巨噬细胞激活，肿瘤相关巨噬细胞可激活人单核样细胞MDSCs免疫抑制作用，促进周围血管生成，影响肿瘤微环境，从而促进肿瘤发展^[15-17]。此外，HPV16-E6促进与宫颈癌细胞共培养后诱导巨噬细胞产生MIF，又可通过作用于宫颈癌细胞来促进细胞的增殖和迁移，抑制细胞凋亡，对宫颈癌发展起到正反馈的作用。

HPV16-E6过表达的宫颈癌细胞，增殖活性增加、细胞凋亡率下降、细胞周期G₀/G₁期缩短而S、G₂/M期延长，说明HPV16-E6可促进宫颈癌细胞增殖、抑制细胞凋亡并参与细胞周期的调控，在加入MIF抑制剂4-IPP后这些作用发生逆转。Guo等^[18]研究表明，宫颈癌细胞中MIF可促进细胞增殖、抑制凋亡和促进G₀/G₁期向S期转化，说明HPV16-E6是通过MIF促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和调控细胞周期。此外，Song等^[19]研究表明，IFN-γ高表达的标本中HPV-E6阳性率明显高于IFN-γ阴性表达的标本，干扰素可通过HP-E6表达诱导产生。Zhang等^[20]研究表明在非小细胞肺癌中上调HPV16-E6、E7表达可诱导氧诱导因子1（HIF1）高表达。HPV-E6可通过诱导激活TGF-β1的启动序列Sp1使TGF-β1基因表达增加，并形成TGF-β1和E6相互促进表达的恶性循环^[21]。而IFN-γ、TGF-β、HIF1等可促进MIF的产生释放^[22-23]。因此，我们认为HPV16-E6可能通过诱导IFN-γ、HIF1和TGF-β等中间分子促使MIF表达增加，从而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，促进宫颈癌发展。

综上所述，本研究证实了HPV16-E6可诱导宫颈癌及其微环境中巨噬细胞MIF的表达和分泌，可通过HPV16-E6/MIF/P53通路促进宫颈癌细胞增殖、抑制凋亡并影响预后。MIF是HPV16-E6导致宫颈癌细胞恶性增殖的重要中间物质，可以成为判断宫颈癌预后的指标之一。