0 引言

肺癌在中国是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，肺癌的转移是导致肺癌患者死亡的重要原因^[1]。上皮细胞间质化过程（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是肺癌转移的关键起始步骤，在肺癌的发生发展中起着重要的作用^[2-3]。

受体酪氨酸激酶样孤儿受体（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1, ROR1）是Ⅰ型受体酪氨酸激酶家族中的成员，参与细胞间信号交流、胞内信号转导等过程，调节细胞增殖、分化和转移^[4]。ROR1主要在胚胎发育过程中表达，而在成年人体细胞和组织中通常不表达^[5]。然而新近研究发现，ROR1在乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中表达，提示ROR1可能参与了恶性肿瘤的发生发展过程^[6-9]。另有研究^[9-10]发现，ROR1在肺腺癌组织中显著高表达，且与临床分期、淋巴结转移、预后不良相关。然而，迄今ROR1在肺癌发生发展中的作用及机制尚不明确。本研究拟探讨过表达ROR1对肺癌A549细胞上皮-间质转化的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

RPMI 1640培养液，胎牛血清，胰蛋白酶购自Gibco公司（上海）；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ROR1、Snail、Twist、Zeb1、p-AKT、AKT抗体购自CST公司（美国）；HRP标记山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG、β-actin购自Santa Cruz公司（美国），预染蛋白质Marker购自Fermentas公司（美国）；RIPA裂解液购自碧云天生物技术公司（上海）；ECL化学发光底物试剂盒购自Pierce公司（美国）；Quick Start Bradford蛋白定量试剂购自Bio-Rad公司（美国）；反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司（大连）；PCR引物由上海生工公司合成；Lenti-Pac™ HIV慢病毒包装试剂盒购自复能基因（广州）；嘌呤霉素购自Sigma公司（美国）；Transwell小室购自Corning公司（美国），其余试剂均为国产分析纯以上。

1.2 细胞培养

人肺癌A549细胞购自中科院上海细胞库。人肺癌A549细胞用含10%胎牛血清（fetal calf serum, FBS）的RPMI 1640培养液，于37℃、5% CO₂的培养箱内饱和湿度培养。

1.3 ROR1稳定细胞株筛选

ROR1慢病毒表达载体（LV-ROR1）及对照慢病毒表达载体（LV-Control）购自广州复能基因有限公司。接种293T细胞于10 cm的培养皿，参照Lenti-Pac™ HIV慢病毒包装试剂盒说明书包装慢病毒，48 h后收集含慢病毒颗粒的上清，离心去除细胞碎片，测定慢病毒颗粒滴度。

接种A549细胞于6孔板贴壁培养，慢病毒感染细胞24 h之后，更换RPMI 1640完全培养液。48 h后采用1 µg/ml嘌呤霉素筛选稳定表达ROR1的细胞株。

1.4 细胞划痕实验

接种细胞于6孔板贴壁培养，待细胞汇合时，用10 µl微量移液枪头垂直于板面划痕，PBS洗涤3次后加入含1%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在倒置显微镜下观察划痕两侧细胞在0、48 h的迁移情况，并拍照分析。

1.5 Transwell侵袭实验

将Transwell小室放入培养板中，在上室加入300 µl预温的无血清培养液，室温下静置15~30 min，使基质胶再水化。消化细胞，用PBS洗2遍，用无血清培养液重悬。调整细胞密度至3×10⁵个/毫升。取细胞悬液200 µl加入24孔板Transwell小室。24孔板下室加入500 µl含FBS的培养液。对24孔板Transwell小室的细胞进行处理。继续培养24 h后用4%多聚甲醛溶液固定小室30 min，结晶紫染色30 min，观察细胞并拍照，在高倍镜下分别选取4个视野统计细胞迁移数，结果取4个数值的平均值。

1.6 Real-time PCR

Real-time PCR按照TRIzol（Invitrogen，英杰生命技术有限公司，美国）说明书方法提取细胞总RNA，按Primescript RT reagent Kit反转录试剂盒（TaKaRa，宝生物工程有限公司，大连）说明书将RNA反转录为cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成，引物序列如下：ROR1上游引物：5’-AATGCAGAGTAACGTGGAAGTGGTC-3’，ROR1下游引物：5’-TGGTCGCTCAATCTCCAGGTC-3’；Snail上游引物：5’-GACCACTATGCCGCGCTCTT-3’，Snail下游引物：5’-TCGCTGTAGTTAGGCTTCCGATT-3’；GAPDH上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，GAPDH下游引物：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。Real-time PCR反应体系及条件参照SYBR Premix Ex Tap^TM试剂盒（TaKaRa，大连），2^–ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量，以GAPDH作为内参。每个实验组重复3次。

1.7 蛋白提取和Western blot分析

收集细胞，PBS洗涤2次后用RIPA裂解液裂解，离心后收集上清液，用BCA法测定蛋白浓度；等量蛋白样品经10%的SDS-PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，ROR1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、Zeb1、AKT、p-AKT、β-actin抗体均以1:1 000比例稀释，4℃孵育过夜。经PBST洗涤后，加入HRP标记的特异性二抗以1:5 000比例稀释，室温下孵育2 h，最后用ECL化学发光试剂对X光片显影，扫描图片。

1.8 统计学方法

应用软件GraphPad Prism 5.0进行统计学分析，实验所得数据用平均数±标准差（x±s）表示，独立样本采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 过表达ROR1对A549细胞侵袭迁移能力的影响

对照组RNA vs. ROR1过表达组RNA：1 vs.（4.8±1.1）（P=0.0009），见图 1A~1B。倒置相差显微镜观察细胞形态发现，A549/ROR1细胞呈梭形“间质细胞样”，散在生长，见图 1C。划痕实验发现过表达ROR1能够明显促进A549细胞的迁移，见图 1D。Transwell实验发现A549/ROR1细胞穿过Transwell小室的数量比对照组A549/Control显著增多，对照组vs. ROR1过表达组：（61±12）vs.（185±23）（P=0.0023），见图 1E。说明过表达ROR1能显著增强A549细胞的侵袭迁移能力。

2.2 过表达ROR1对A549细胞EMT相关标志物表达的影响

过表达ROR1能明显抑制E-cadherin的表达、促进Vimentin、N-cadherin的表达。进一步检测过表达ROR1对EMT相关转录因子表达的作用，结果发现过表达ROR1能够促进转录因子Snail的表达，而对Twist、Zeb1的表达没有明显的影响，见图 2。

2.3 干扰Snail对ROR1诱导A549细胞EMT的影响

在过表达ROR1的A549细胞进一步干扰Snail，对照组RNA vs. Snail干扰组RNA：1 vs.（0.25±0.13）（P=0.0007），见图 3A。48 h后取细胞总蛋白，Western blot结果显示转染Snail siRNA能明显上调E-cadherin蛋白的表达，下调Vimentin、N-cadherin蛋白的表达，见图 3B。说明干扰Snail能够逆转ROR1对A549细胞EMT的诱导作用。

2.4 干扰Snail对ROR1诱导A549细胞侵袭迁移的影响

在过表达ROR1的A549细胞进一步干扰Snail，细胞划痕实验结果显示干扰Snail能明显抑制ROR1对A549细胞迁移的诱导作用，见图 4A。Transwell实验结果发现Snail干扰组穿过基质胶的侵袭细胞数明显少于ROR1过表达组，ROR1过表达组vs. Snail干扰组：（182±10）vs.（110±22），差异有统计学意义（P=0.0130），见图 4B。

2.5 AKT介导ROR1对A549细胞EMT的诱导作用

分别提取A549/ROR1和A549/Control细胞总蛋白，Western blot法检测AKT的表达及磷酸化水平。结果发现过表达ROR1能够促进AKT的磷酸化，但是对AKT蛋白表达无明显的影响，见图 5A，结果说明ROR1能够促进AKT信号通路的活化。为进一步观察ROR1激活AKT信号是否介导ROR1对EMT的诱导作用，采用AKT抑制剂LY294002处理A549/ROR1细胞后发现，LY294002能够明显抑制Snail和Vimentin的表达，但是能促进E-cadherin的表达，见图 5B，结果说明ROR1激活AKT信号参与了ROR1对EMT的诱导作用。

3 讨论

近年来，ROR1在多种恶性肿瘤中异常表达已引起广泛关注。MacKeigan等最先发现ROR1具有原癌基因的作用^[11]。随后，多项研究表明ROR1能够体内外促进肿瘤生长，在肿瘤恶性进展中发挥着促进作用^[6-9]。研究发现，ROR1在转移潜能较高的低分化肿瘤中高表达，且与EMT相关标志物的表达相关^{[6, 12]}。靶向抑制ROR1能够明显抑制乳腺癌细胞迁移与浸润能力^[12]。然而，ROR1是否参与肺癌EMT发生尚不明确。本研究转染ROR1过表达质粒至肺癌A549细胞中，结果显示过表达ROR1能够诱导肺癌细胞EMT，上调间质性标志物Vimentin、N-cadherin的表达，而下调上皮间质转化标志物E-cadherin的表达。细胞划痕、Transwell实验进一步证明过表达ROR1能够促进肺癌细胞侵袭迁移能力。

肿瘤EMT发生主要受一类转录抑制因子超家族成员所调控，转录因子Snail是肿瘤细胞EMT的关键调控因子^[13]。Snail是一种锌指DNA结合蛋白，主要通过与钙黏素（E-cadherin）启动子区的E-box连接基序结合，抑制E-cadherin的转录表达，从而参与调控EMT过程。此外，Snail也能通过其他方式参与调控EMT，如增强间质细胞/成纤维细胞标志物表达（N-cadherin、vimentin、Fibronectin等）^[14]。我们发现ROR1处理显著促进A549细胞Snail蛋白的表达，而干扰Snail能够逆转ROR1对A549细胞EMT的诱导作用。

已知Snail的表达与活性受细胞内多条信号通路调节，如TGF-β1/Smad、TNF-α/NF-κB、AKT等信号^[15-16]。此外，研究发现AKT信号参与了TGF-β促进EMT发生，AKT通过磷酸化失活GSK-3β而上调Snail的表达^[17]。我们发现过表达ROR1能够促进AKT的磷酸化，而采用AKT抑制剂能够逆转ROR1对Snail的表达调控作用。提示ROR1可通过AKT/Snail信号促进肺癌细胞EMT转化。与本研究结果类似，Fernández等^[18]同样发现ROR1能够激活PI3K/AKT信号而促进黑色素瘤细胞生长和迁移。新近研究发现，ROR1能够调控EGFR/ErbB3异源二聚化，并进一步诱导c-Src的磷酸化/活化^[19]。已知Src是一种非受体酪氨酸蛋白激酶，活化的Src可通过激活AKT、MAPK等多种信号参与细胞内信号转导的过程^[20]。另有研究表明ROR1能够与蛋白激酶CK1结合而直接激活PI3K/AKT^[6]。因此，ROR1促进AKT磷酸化可能与ROR1调控c-Src或CK1的活性有关，然而具体作用机制还有待进一步研究。

总之，本研究发现ROR1能通过调节AKT/Snail信号促进肺癌A549细胞EMT转化，进而增强细胞浸润和转移能力，为靶向ROR1抑制肺癌EMT及转移提供重要的理论基础。