0 引言

小细胞肺癌约占肺癌的20%，是肺癌中起源于较大支气管的肺Kulchitsky细胞的一种未分化癌，其恶性程度较高、进展快、生存期短、预后较差^[1]。小细胞肺癌对放疗及化疗敏感度均较高，治疗上应以全身化疗为主，联合放疗为主要治疗手段，早期对放化疗敏感，但极易出现放化疗抵抗而导致治疗失败^[2]。因此，SCLC的多药耐药已成为目前临床亟待解决的难题。

LncRNA是指一类长度超过200个核苷酸的RNA分子的总称，已经成为当今分子生物学最热门的前沿研究领域之一^[3]。虽然在人类基因组中已经发现了一些LncRNA，但关于其对基因组的调控及具体机制尚不清楚。前期预实验通过LncRNA芯片发现长链非编码RNA AC009336.24在SCLC耐药细胞株中的表达较化疗敏感细胞株明显增高，提示LncRNA AC009336.24可能与SCLC的耐药相关，然而关于LncRNA AC009336.24在SCLC中的表达及意义，目前国内外尚未见相关报道。本研究应用实时荧光定量PCR法检测LncRNA AC009336.24在SCLC组织中的表达，分析其与患者临床病理特征及化疗敏感度的关系。

1 资料与方法 1.1 病例资料

收集2012年1月—2016年12月在川北医学院附属医院肿瘤科、胸外科及呼吸内科进行手术或穿刺活检或支气管镜活检的SCLC组织标本120例，其中35例为手术切除的SCLC患者的癌旁组织（距离癌组织≥2 cm），75例未进行手术治疗的患者的癌组织取自支气管镜或CT引导下的穿刺活检标本。所有患者的病例资料完整，手术前均未接受过放化疗。同期收集40例因各种原因导致肺外伤的正常肺组织标本作为对照组。120例SCLC患者中，男69例、女51例；年龄30~77岁，平均年龄为（54±3.5）岁；局限期49例，广泛期71例；淋巴结转移者66例，无淋巴结转移者54例；远处转移者62例，无远处转移者58例。120例患者均接受以铂类为主的化疗，首先给予一线化疗方案（依托泊苷+铂类）化疗；出现耐药后，给予二线化疗方案（伊立替康+铂类）。其中化疗敏感者（化疗4~5个周期后肿瘤缩小30%以上或消失）48例，化疗耐药者（化疗4~5周期后肿瘤增大30%或以上，或出现新的转移灶）72例；其中72例耐药者给予二线化疗方案治疗。本研究经我院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 随访

所有患者出院后都进行了随访，主要以电话和门诊进行随访，随访内容包括一般情况、临床症状及影像学检查（胸腹部CT、浅表淋巴结彩超）。随访起点为手术或病理活检日期，随访时间为4~66月，中位随访时间为42月，随访截止日期为2017年6月30日。至随访结束，存活44例，死亡76例。无失访病例。

1.3 实时荧光定量PCR法检测SCLC组织中LncRNA AC009336.24的表达水平

应用TRIzol（美国Invitrogen公司产品）试剂提取SCLC组织、癌旁组织及正常肺组织标本中的总RNA。将提取的总RNA，参照AMV反转录试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司产品]说明书提供的方法将其反转录成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix[宝生物工程（大连）有限公司产品]，以cDNA为摸板，进行实时荧光定量PCR。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR反应条件：95℃ 10 min；（95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s）共40个循环。以2^-ΔΔCt值表示LncRNA AC009336.24的表达水平。

1.4 统计学方法

用SPSS13.0软件进行数据统计分析。计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用χ²检验，Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线，并进行Log rank检验；单因素及多因素分析影响SCLC预后的因素，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 LncRNA AC009336.24在SCLC组织中的表达

实时荧光定量PCR检测LncRNA AC009336.24在120例SCLC组织、35例癌旁组织及40例正常肺组织中LncRNA AC009336.24的表达，结果提示LncRNA AC009336.24在SCLC组织中的平均表达水平（8.45±1.320）显著高于癌旁组织（1.370±0.220）及正常肺组织（1.080±0.140），差异有统计学意义（F=17.83, P < 0.001），见图 1A。进一步分析发现LncRNA AC009336.24在耐药患者中的表达明显高于化疗敏感者，差异有统计学意义（t=14.63, P < 0.001），见图 1B。

2.2 LncRNA AC009336.24表达与SCLC患者临床病理特征的关系

进一步分析LncRNA AC009336.24表达与患者临床病理特征的关系，结果发现LncRNA AC009336.24表达与患者的年龄、性别、吸烟无关（均P > 0.05），而与疾病分期、淋巴及远处转移、化疗敏感度及患者的生存状态明显相关（均P < 0.05），见表 1。

2.3 LncRNA AC009336.24表达与SCLC患者生存时间的关系

采用Kaplan-Meier法绘制SCLC患者的无进展生存及总生存曲线，结果发现LncRNA AC009336.24高表达患者的无进展生存时间（（11.32±2.27）月）短于低表达者（（18.93±1.66）月），差异有统计学意义（χ²=12.87, P=0.003），见图 2A；LncRNA AC009336.24高表达患者的总生存时间（（19.35±1.73）月）短于低表达者（（29.25±2.47）月），差异有统计学意义（χ²=21.43, P < 0.001），见图 2B。

2.4 单因素及多因素分析影响SCLC患者预后的因素

单因素分析发现，疾病分期、淋巴转移、远处转移、化疗敏感度、LncRNAAC009336.24表达与SCLC患者的OS有关（均P < 0.05）；多因素分析结果显示，疾病分期、远处转移、LncRNAAC009336.24表达是SCLC患者预后的独立影响因素（均P < 0.05），见表 2。

3 讨论

小细胞肺癌细胞生物学特性复杂：生长快、转移早、恶性程度高，属于一种特殊类型肺癌^[4]，其对放化疗敏感，应视为全身性肿瘤进行治疗，医疗界对其治疗方法长期存在争论^[5-6]。上世纪70年代以前，手术治疗为首选，但疗效甚差，其原因有：术前体内微型转移灶未能得到控制，加上术中挤压、出血可使免疫力下降，术后很快会发生胸内复发及颅内、骨髓及肝脏等远处转移^[7-8]。SCLC患者对化疗和放疗都非常敏感，但极易产生耐药和放疗抵抗，导致治疗失败^[9]，其具体的作用机制尚未完全阐明。

LncRNA是一类转录本长度超过200 nt的ncRNA，LncRNA一度曾被认为仅仅是RNA聚合酶Ⅱ转录时的副产物，是基因转录时的“噪音”和“垃圾”，并不具有特定的生物学功能，是一个“暗物质”。然而，近年来的研究发现，LncRNA在多种类型肿瘤细胞（包括肺腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等）的増殖、克隆、调亡、侵袭、转移及药物耐药等方面均发挥着重要的作用，越来越多的LncRNA在基因调节等方面的功能被揭示出来^[10-12]。LncRNA有望成为新的肿瘤标志物和肿瘤治疗靶点，在肿瘤诊断和治疗方面显示出良好的临床应用前景。有研究发现，转移相关肺腺癌转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）作为早期肺腺癌患者预后的一个独立预后标志物，是第1个在肺癌中被研究的LncRNA^[13]。HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA, HOTAIR）在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）组织中高表达，HOTAIR高表达状态与NSCLC患者的淋巴结转移及临床分级相关，并预示着患者预后相对较差^[14]。结肠癌相关转录因子2（colon cancer associated transcript 2, CCAT2）在NSCLC组织中高表达，CCAT2的高表达与肺腺癌差的预后相关，提示CCAT2可能是一个肺腺癌特异的LncRNA^[15]。LncRNA生长停滞特异性转录本5（growth arrest-specific transcript 5, GAS5）在NSCLC组织中低表达，其表达水平与NSCLC的肿瘤大小及临床分级有关。LncRNA GAS6-AS1在NSCLC组织中低表达，其表达水平与NSCLC患者的淋巴结转移以及临床分级有关，而且GAS6-AS1是NSCLC患者的一个独立预后标志物^[16]。Niu等^[17]研究发现，牛磺酸调节基因1（taurine upregulated gene 1, TUG1）参与调节SCLC的生长和化疗耐药。LncRNA浆细胞瘤变异易位基因1（plasmacytoma variant translocation 1, PVT1）的上调是SCLC患者预后较差的标志物，参与调节SCLC患者的侵袭和迁移^[18]。

本研究小组前期通过LncRNA芯片发现，LncRNA AC009336.24在SCLC耐药细胞株中的表达高于化疗敏感细胞株，提示LncRNA AC009336.24可能与SCLC的发生和发展有关。本研究通过实时荧光定量PCR法检测120例SCLC组织、35例癌旁组织及40例正常肺组织中LncRNA AC009336.24的表达，分析LncRNA AC009336.24表达与SCLC患者临床病理特征及预后的关系。结果发现SCLC组织中LncRNA AC009336.24的表达水平明显高于癌旁组织及正常肺组织。LncRNA AC009336.24在化疗耐药患者中的表达明显高于化疗敏感者；LncRNA AC009336.24表达与SCLC患者的性别、年龄无关，而与疾病分期、淋巴结转移、远处转移、化疗耐药相关。高表达LncRNA AC009336.24患者的总生存时间及无进展生存时间均短于低表达者。单因素及多因素分析发现LncRNA AC009336.24表达、疾病分期、远处转移是SCLC患者独立的预后因素。以上研究结果提示，LncRNA AC009336.24参与调节SCLC的发生和发展，可能作为潜在的SCLC患者疗效及预后评估的生物标志物。然而，影响SCLC预后的分子机制复杂，LncRNA AC009336.24调节SCLC患者预后的具体作用机制及参与的信号通路，尚需进一步研究。