0 引言

结肠癌的发病与许多危险因素有关，最近的研究表明肠道菌群可能在结肠癌发病过程中发挥着重要作用^[1]。有关肠道致病菌诱发肠道炎性反应以及炎性肠病的发病机制已经建立的较为完善^[2-5]。然而肠道菌群引起结直肠癌的具体致病机制仍然停留在假说阶段。其中较为经典的菌群-结直肠癌发病模型包括Sears和Pardoll^[6]提出的“Alpha-bug”模型和Tjalsma等^[7]提出的“driver-passenger”模型。与幽门螺杆菌与胃癌关系不同，诱发肠癌的病原体并非某种单一的致病微生物而是由多种病原微生物构成的肠道细菌群落，后者所构成的高阶结构称为细菌生物膜。同样有研究表明健康者与结直肠癌患者粪便中的微生物种类存在巨大差异^[8-9]。目前，细菌生物膜促进结直肠癌发生的作用机制是研究的热点。

1 细菌生物膜概述

自然界中的绝大多数细菌主要以两种方式生长，一种是浮游方式，另一种是生物膜方式。细菌生物膜又称为细菌生物被膜，是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体^[10]。生物膜中水份含量高达97%。除了水和细菌外，当细菌吸附于表面后，还会分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物以维持生物膜的存活，而游离的单个或单片菌落较容易被抗生素杀死。因此细菌生物膜内含有蛋白质、多糖、核酸、肽聚糖、磷脂等多种生物大分子。

细菌生物膜多细胞结构的形成是一个复杂的动态过程，主要包括四个阶段：细菌可逆性黏附的定植阶段、细菌不可逆性黏附的集聚阶段、生物膜的发展和成熟阶段以及细菌的脱落与再定植阶段。细菌生物膜既可以由单一菌株形成，也可以由多种菌株构成。

人体内细菌生物膜的形成会引起多种炎性反应性疾病和抗生素耐药。据美国疾病控制与预防中心估计至少有65%的人类细菌感染与生物膜有关^[11]，其中肠球菌等致病菌形成的生物膜与炎性肠病发病密切相关^[12-13]。最近研究认为生物膜不但可以引起肠道免疫炎性反应，也可能与肠道上皮细胞恶变有关。结合当前的研究现状，我们认为细菌生物膜促进肠道上皮细胞发生致癌转化主要通过直接作用和间接作用两种方式。前者是指生物膜细菌自身的组成结构可以直接作为致癌转化过程中的触发点，后者是指生物膜通过产生某些物质（包括细菌毒素和酶等）或提供生化反应的界面，以产生持续的炎性反应或改变宿主的代谢状况。二者的最终结果均影响了肿瘤微环境并诱发癌变。

2 细菌生物膜的直接致癌作用

肠道中的很多革兰氏阴性杆菌（如肠杆菌属和沙门菌属）的菌体表面均具有菌毛结构。以往的观点认为，菌毛主要与细菌的黏附作用有关，其本身的组成成分与其致病性并无直接关系。近年来研究表明，正常菌毛在某些条件下会转变成一种直径更细，呈不规则卷曲且高度聚集的菌毛，即“curli”菌毛^[14]。“curli”菌毛含有一类功能性的淀粉样纤维，后者是组成细菌生物膜的重要结构^[15]。最新研究表明在结肠炎小鼠模型中，“curli”能够以配体的形式同TLR2高效结合诱导初始CD4+T细胞分化为Th17细胞，并进一步诱发IL-17A/IL-22相关的宿主炎性反应^[16-17]。而Th17细胞依赖的炎性反应，即IL-23/IL-17信号轴的持续激活会引发DNA损伤，并最终导致肿瘤的形成^[18-19]。研究指出组成“curli”的淀粉样纤维的亚基是由一种九聚化的CsgG通道蛋白构成^[15]。在该结构的基础上进行细菌遗传学和生物化学分析，可以进一步阐释功能性淀粉样纤维生成的机制，并为抑制细菌生物膜形成的新型药物提供了重要信息。

3 细菌生物膜的间接致癌作用

事实上，不但在健康者和肠癌患者中肠道细菌的种类和比重存在一定差异，在肠癌发病的不同阶段（如腺瘤和腺癌）肠道细菌的构成也有所不同^[20-22]。Feng等^[20]对156例健康者、大肠腺瘤和大肠癌患者的粪便样本进行宏基因组测序，结果表明大肠腺瘤和大肠癌的粪便标本拟杆菌属的水平高于健康者，而胃瘤菌属的水平却低于健康对照组。付文政等^[21]的实验分别对31例健康者，31例腺瘤患者，31例肠癌患者的粪便进行了DNA指纹图谱分析，结果发现健康者的拟杆菌属、罗氏菌属所占比例分别达到21.00%和4.10%，要高于大肠癌组的14.00%、1.56%和大肠腺瘤组的16.03%，1.62%。而大肠癌组的肠球菌属、链球菌属所占比例为2.34%、1.19%，大肠腺瘤组的比例分别为2.12%、1.09%，二者均高于健康者的0.10%、0.45%。除了粪便标本以外，这种差异也存在于手术标本之中。如Dejea等^[22]对肠癌手术标本的生物膜构成菌进行分析，结果发现以梭杆菌属为优势菌种的细菌生物膜在肿瘤组织中所占的比例达到了32%，而健康对照组中没有一例标本的优势菌种为梭杆菌属。这种差异的存在可以用“driver-passenger”模型来说明。该模型认为最初某些特定的肠道固有菌诱发了上皮细胞DNA损伤, 这些肠道固有菌被定义为“drivers”；其次，癌变过程介导了肠道微环境的改变, 这种改变有利于另外一些细菌的增殖存活, 这些细菌被定义为“passengers”^{[7, 23]}。以肠产毒性脆弱拟杆菌（enterotoxigenic Bacteroides fragilis, ETBF）为例，ETBF通过分泌脆弱拟杆菌肠毒素（B fragilis toxin, BFT）激发了结肠上皮细胞的炎性反应和局部肿瘤微环境的改变，并激活下游多种信号转导通路和DNA损伤机制。与此同时，肿瘤微环境的改变使得梭杆菌属和链球菌属等“passengers”逐渐代替包括ETBF在内的“drivers”并最终导致肠癌进展^{[6, 24-25]}。除了可以产生基因毒素外，细菌生物膜还可以通过改变宿主某些代谢产物水平和抑制肠道共生菌生长来致癌。

3.1 细菌生物膜有助于某些基因毒素的产生

由肠道细菌产生基因毒素主要包括产毒性脆弱拟杆菌毒素（BFT）、大肠杆菌素和细胞膨胀致死毒素（cytolethal distending toxin CDT）等，其中以BFT与结肠炎、结肠癌发生的作用机制研究较为清楚。有大量实验证明BFT可以通过多种途径改变肿瘤微环境致癌^[23-29]。其中Th17细胞介导的免疫应答起着至关重要的作用。最初ETBF定植于肠黏膜并诱发Th17细胞所介导的炎性反应，其中IL-23/IL-17信号轴的持续激活释放了大量炎性反应性细胞因子（包括IL-17、IL-6、IL-22等），并进一步导致结肠炎^[26]。Wu等^[27]研究表明在APC^Min/+小鼠模型中，用拮抗剂阻断IL-17和IL-23受体（IL-23R），显著抑制了ETBF诱导的结肠炎。而Grivennikov等^[28]实验证明在CPC-APC小鼠模型中，通过对小鼠使用广谱抗生素的短期（3周）鸡尾酒疗法消除肠道菌群后，肿瘤细胞IL-17 mRNA的表达和STAT3的激活显著降低。因此，IL-23/IL-17信号轴持续激活可能与ETBF等具有致癌潜能的细菌构成的生物膜致癌效应密切相关。

在正常肠道上皮细胞转化成癌细胞的过程中，BFT等细菌毒素诱发的基因毒性反应也尤为重要。例如，Goodwin等^[24]的研究表明BFT可以增加HT29/C1和T84结肠细胞系的精胺氧化酶（spermine oxidase, SMO），导致大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生，而ROS可以激活NLRP3炎性体并诱导DNA损伤^[29]，并最终诱发肠上皮细胞发生恶性增殖。

除了激发Th17细胞相关的免疫反应和诱导DNA损伤以外，BFT与正常肠道黏膜屏障的破坏也密切相关。有研究发现在肠癌患者中，被生物膜覆盖的肠隐窝上皮细胞IL-6和E-cadherin表达水平显著降低，肠道上皮的通透性显著增加^[22]。生物膜介导的E-cadherin缺失激活了下游的Wnt信号通路，它同IL-6/STAT-3通路一起在肠癌发生发展过程中起到了关键作用。除此以外，研究表明IL-17/IL-23持续激活的大肠腺瘤和肠癌组织中黏蛋白和连接黏附分子（junctional adhesion molecules, JAM）的表达量都明显减少^{[28, 30]}。因此，我们提出生物膜很可能是通过增强肠上皮细胞的通透性和增加致病菌与裸露肠道上皮的直接接触，从而诱导持续的炎性反应并进一步诱发癌变。

3.2 细菌生物膜可以增高宿主致癌代谢产物的水平

Gerner等^[31]研究表明多胺类物质可以诱发真核细胞增殖。同位素代谢失踪提示N1, N12二乙酰精胺（N1, N12-diacetylspermine）是多胺代谢的终产物之一。之后Johnson等代谢组学实验结果表明在生物膜阳性的肠癌组织和健康组织中，N1, N12二乙酰精胺的表达水平均显著升高。而术前24 h口服抗生素消除生物膜的肠癌患者和对应健康组织中的N1, N12二乙酰精胺的表达水平较未口服者均明显降低。这可能与生物膜能够产生更多的精脒/精胺N1-乙酰转移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase, SSAT）有关^[32]，而后者被认为是多胺分解代谢的限速酶。因此，多细菌形成的生物膜可能是通过提高乙酰多胺类物质的代谢水平诱发结肠上皮细胞发生恶性增殖的。

除了产生某些具有致癌效应的酶类，生物膜结构还可以为肠道内的生化反应提供良好的反应场所。以次级胆汁酸生成为例，肝脏以胆固醇为原料合成初级胆汁酸后随胆汁排入肠腔，并经肠道细菌分泌的7α-脱羟基酶作用转化为脱氧胆酸（deoxycholic acid, DCA）、石胆酸（lithocholic acid, LCA）等次级胆汁酸。次级胆汁酸已被证实具有一定的促癌作用^[33-34]。DCA可以损伤肠黏膜细胞DNA和氧化应激，诱导上皮细胞增殖，促使结肠癌发生^{[33, 35]}。此外，在人结肠癌细胞系HCT116中，DCA还可以抑制抑癌基因p53的表达^[36]。肠道中次级胆汁酸的生成高度依赖于7α-脱羟基酶，其中生物膜可能为初级胆汁酸的降解和脱羟基作用提供了高效的反应界面^[37]。因此，被生物膜覆盖的肠上皮细胞可能较生物膜阴性者周围环境的次级胆汁酸浓度更高。

3.3 细菌生物膜可通过抑制肠道益生菌生长发挥致癌效应

前文叙及，在肠癌发生发展过程中，随着肿瘤微环境的改变肠道中的“drivers”因无法适应逐渐被“passengers”所替代。其中除了脆弱拟杆菌外，还有大量对人体有益的肠道共生菌生长会受到抑制。Dejea等^[22]证明生物膜的细菌构成以拟杆菌门、梭杆菌门和毛螺菌科为主，不包括双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌。而后者已被证明可以通过多种方式抑制肿瘤的生长。如Kim等^[38]研究表明青春双歧杆菌SPM0212可通过下调β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶和尿素酶等致癌酶的活性抑制结肠癌细胞增殖。Gajewski等^[39]发现将双歧杆菌加入到小鼠的消化道中，能够加强其免疫系统对肿瘤细胞的攻击能力。而且同时服用双歧杆菌和免疫检查点抑制剂（如抗PD-L1信号通路抗体）的小鼠较单独服用PD-L1抗体者，其抗肿瘤的强度要明显增强，肿瘤的增长几乎为零。其他益生菌的作用也被大量实验所证实。如Walia等^[40]证实植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的摄入可降低环氧合酶-2和总唾液酸水平抑制结直肠癌的发生发展。Chen等^[41]通过实验证明丁酸梭菌和枯草杆菌可抑制二甲肼诱导的结直肠癌发生, 表明此两种益生菌具有预防和抗肿瘤效应。

4 展望

越来越多的证据表明，细菌生物膜可以通过改变肠道上皮的通透性和诱发持续的炎性反应。因此，我们推测在肠道菌群诱发肠癌的过程中，生物膜的形成可能是非常重要的。但Dejea等^[22]研究发现位于结肠肝曲近端的肿瘤（包括腺瘤和腺癌）生物膜阳性率极高，而肝曲远端至直肠末端的肿瘤生物膜阳性率很低。这提示位于肝曲远端的肠道菌群可能以一种生物膜非依赖性的方式致癌。同左半结肠肿瘤相比，右半结肠肿瘤的恶性程度更高、患者的预后更差^[42-44]。这种差别可能与生物膜空间分布的差异有关。因此，拮抗生物膜的致癌效应可能会成为未来癌症治疗的一个新方向。然而，有关生物膜的形成和致癌的具体机制仍需进一步的探索。