2018, Vol. 45文章信息
- BCYRN1对乳腺癌细胞MCF7和小鼠移植瘤增殖和转移的影响
- Influence of BCYRN1 on Proliferation and Migration of Breast Cancer Cell Line MCF7 and Tumor-bearing Mice
- 肿瘤防治研究, 2018, 45(4): 205-209
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2018, 45(4): 205-209
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2018.17.0691
- 收稿日期: 2017-09-11
- 修回日期: 2017-11-20
引用本文 |
2. 436000 鄂州，鄂州市中心医院普外科
2. Department of General Surgery, Ezhou Central Hospital, Ezhou 436000, China
长链非编码RNA（lncRNAs）的发现拓展了靶向治疗的范围，已报道多种lncRNAs在乳腺癌的发展过程中起着重要作用，这些lncRNAs具有成为乳腺癌治疗靶点的潜能[1]。BCYRN1已报道在多种癌症中表达异常，这种异常表达可能与癌症的发生发展存在着一定关系[2]。有研究报道BCYRN1在浸润性乳腺癌和正常组织的表达存在很大差异[3]。为了进一步探索BCYRN1在乳腺癌中的作用，本研究采用siRNA技术干扰BCYRN1基因，在乳腺癌细胞MCF7和荷瘤小鼠上进行了体内外研究，现报道如下。
1 材料与方法 1.1 细胞系与主要试剂乳腺癌细胞系MCF7购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。RPMI 1640培养液和胎牛血清以及转染试剂TurboFect Transfection Regent购自赛默飞世尔科技公司（Grand Island, US）。Cell Counting Kit-8（CCK-8）购自日本同仁化学公司。Transwell小室及人工基底膜均购自美国BD公司。细胞增殖核抗原-67（antigen identified by monoclonal antibody, Ki-67）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein 9, MMP-9）抗体购自美国NEB公司。
1.2 细胞培养与转染乳腺癌细胞培养于10%胎牛血清和1%的青-链霉素的RPMI 1640培养液中，并置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。当细胞增殖到80%时进行传代培养。依照转染试剂TurboFect Transfection Regent说明书将BCYRN1 siRNA和siRNA scramble分别转染乳腺癌细胞MCF7，未转染的MCF7为阴性对照组，siRNA scramble为对照组。
1.3 CCK-8检测细胞增殖用CCK-8试剂分别检测三组细胞在转染后0、24、48、72和96 h的增殖状况，首先将CCK-8溶液用培养液稀释到10%，然后将待测细胞悬浮于上述稀释液中，在37℃恒温培养箱中培养4 h，检测450 nm处吸光度值，计算细胞增殖倍数。
1.4 蛋白印迹检测细胞中的蛋白表达收集三组细胞，PBS清洗三次，用添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解，提取总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，经5%的BSA封闭后依次孵育相应的一抗和二抗。显色并统计灰度值计算相对表达量。
1.5 划痕实验分析细胞运动能力将细胞密度为1×106/ml的细胞悬液加入到6孔板中，过夜培养至形成单层细胞。在单层细胞上用10 μl的枪头划横线，PBS洗3次，洗去因划痕而脱落的细胞。此时显微镜下拍照为0 h的样，继续培养24 h后再取出拍照为24 h的样。
1.6 MCF7荷瘤小鼠模型建立5周龄的雌性小鼠购自四川大学华西医院基因工程小鼠中心。BCYRN1 siRNA和siRNA scramble分别对乳腺癌细胞MCF7进行转染，将上述细胞悬液分别感染小鼠，建立MCF7荷瘤小鼠模型。每5 d测量一次肿瘤体积，Ⅴ=长×宽2/2。
1.7 免疫组织化学法分析组织中蛋白表达取出肿瘤组织后用PBS清洗8次，去掉坏死组织及血凝块。用4%的多聚甲醛在4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50%和70%的酒精依次清洗。脱水、石蜡包埋，1% triton-100处理15 min，3%的H2O2处理15 min，5%的羊血清封闭30 min后依次孵育一抗和二抗。染色封片。
1.8 统计学方法用SPSS 16.0软件对实验数据进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 siRNA干扰BCYRN1表达对MCF7细胞增殖的影响利用CCK-8检测转染不同时间的细胞增殖能力。转染72 h后BCYRN1 siRNA干扰组的细胞增殖倍数明显低于对照组，转染96 h的细胞增殖倍数远远低于对照组（P < 0.05），见图 1。可见，siRNA干扰BCYRN1后可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖能力。
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| *: P < 0.05, compared with control group, siRNA scramble was control group 图 1 CCK-8法检测MCF7细胞增殖 Figure 1 Proliferation of MCF7 cells detected by CCK-8 |
BCYRN1 siRNA处理乳腺癌细胞MCF7后，增殖标记蛋白Ki-67和PCNA的表达受到抑制，见图 2A。BCYRN1 siRNA干扰组中Ki-67和PCNA的相对表达量明显低于对照组，约减少2倍（P < 0.05），见图 2B~2C。
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| *: P < 0.05, compared with control group 图 2 蛋白印记法检测细胞增殖标记蛋白表达 Figure 2 Cell proliferation marker protein expression tested by Western blot |
利用划痕实验分析BCYRN1 siRNA对乳腺癌细胞MCF7运动能力的影响。结果显示，划线24 h后，BCYRN1 siRNA干扰组的缝隙间距明显大于对照组，这说明抑制BCYRN1的表达可减弱乳腺癌细胞MCF7迁移能力，见图 3。
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| Healing crack was observed by inverted microscope (×40) 图 3 划痕实验检测细胞迁移能力 Figure 3 Cell migration detected by wound healing assay |
为了进一步证实BCYRN1对细胞迁移的影响，通过蛋白印迹检测迁移标记蛋白VEGF和MMP-9的表达。结果表明，BCYRN1 siRNA干扰组迁移标记蛋白VEGF和MMP-9的表达低于对照组，见图 4A。统计结果显示，BCYRN1的抑制会导致迁移标记蛋白VEGF和MMP-9表达下调（P=0.04），见图 4B~4C。
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| *: P < 0.05, compared with control group 图 4 蛋白印记检测迁移标记蛋白表达 Figure 4 Migration marker protein expression tested by Western blot |
用转染BCYRN1 siRNA或对照组的乳腺癌细胞MCF7感染小鼠，每5天测量一次肿瘤的体积。感染小鼠30天后，实验组小鼠BCYRN1 siRNA的肿瘤明显小于对照组，见图 5A。每5天一次统计肿瘤体积，结果显示，BCYRN1 siRNA组的肿瘤体积明显小于对照组（P=0.03），见图 5B。由此可见，siRNA干扰BCYRN1后可以抑制乳腺肿瘤的生长。
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| A: the tumor tissues of MCF7 tumor-bearing mice; B: tumor volume (5-30 days); *: P < 0.05, compared with control group 图 5 BCYRN1 siRNA抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长 Figure 5 Tumor growth was inhibited by BCYRN1 siRNA |
免疫组织化学进一步检测BCYRN1对乳腺肿瘤增殖和迁移的影响。BCYRN1 siRNA组荷瘤小鼠的肿瘤组织中，增殖标记蛋白Ki-67和迁移标记蛋白MMP-9的表达都低于对照组，见图 6。上述结果表明，siRNA干扰BCYRN1可抑制乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤组织增殖标记蛋白Ki-67和迁移标记蛋白MMP-9的表达。
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| 图 6 肿瘤组织增殖标记蛋白和迁移标记蛋白表达(免疫组织化学×100) Figure 6 Expression of cell proliferation and migration marker proteins (Immunohistochemical staining ×100) |
中国新诊断乳腺癌病例占全球的12.2%，乳腺癌死亡率占世界的9.6%[4]。中国乳腺癌发病率和死亡率都呈现上升趋势，中国乳腺癌发病率的增长速度是世界乳腺癌增长率的2倍[5-6]。另外中国庞大的人口基数使得中国乳腺癌患者的人数众多，2013年，中国新发病例27.9万，死亡病例约6.5万[7]。乳腺癌治疗对医疗健康事业是一个重大考验。
前列腺癌、膀胱癌、肾癌和肺癌等多种癌症的形成及迁移都会受长链非编码RNA的调控[8-10]。Su等发现了1 623种与乳腺癌相关的lncRNAs，其中部分lncRNAs与多种癌症都存在一定关系[11]。进一步分析发现，与癌旁组织相比，乳腺癌组织中存在790种高表达和637种低表达lncRNAs[12]。目前有文献报道乳腺癌异常表达的lncRNAs主要有HOTAIR、MALAT-1、UCA1、GAS5、NBAT1、XIST、H19和BCYRN1等[13-14]。
多项研究表明肿瘤细胞的增殖会受到lncRNAs的调节。lncRNA SPRY-IT1对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-435S都具有促进细胞增殖的作用[15]。lncRNA H19则可以促进乳腺癌细胞MCF7的增殖[16]。沉默lncRNA MVIH和lncRNA UCA1会抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖[17-18]。本研究发现siRNA BCYRN1转染72 h后，乳腺癌细胞MCF7的增殖倍数明显减少，且增殖标记蛋白Ki-67和PCNA的表达也受到了抑制。这些结果说明siRNA干扰BCYRN1可以抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖。
lncRNAs不仅可以影响细胞增殖，还会对细胞迁移进行调控。Hu等通过划痕实验发现lncRNA NBAT1会降低乳腺癌细胞MCF7的迁移能力[19]。lncRNA BCYRN1除影响卵巢癌细胞增殖外，还可以促进支气管哮喘大鼠模型中平滑肌细胞的迁移[20]。另外，在肺癌中，lncRNA BCYRN1的表达下调会导致迁移标记蛋白MMP-9表达的降低[21]。本研究结果亦显示，沉默BCYRN1可以减弱乳腺癌细胞MCF7的运动能力并抑制迁移标记蛋白VEGF和MMP-9的表达。由此可见，siRNA BCYRN1会抑制乳腺癌细胞MCF7的迁移能力。
lncRNAs在肿瘤生长和迁移方面也发挥着重要作用。有研究表明干扰乳腺癌细胞MDA-MB-231的长链非编码RNA linc-ROR的表达并建立乳腺癌小鼠模型，8周后发现肿瘤的形成和转移受到明显抑制[22]。本研究通过转染BCYRN1 siRNA和对照组的乳腺癌细胞MCF7建立乳腺癌荷瘤小鼠模型，BCYRN1 siRNA小鼠的肿瘤明显变小，且肿瘤组织增殖标记蛋白Ki-67和迁移标记蛋白MMP-9的表达也受到了抑制，BCYRN1下调表达可抑制MCF7荷瘤小鼠肿瘤的生长和迁移。
本研究表明siRNA干扰BCYRN1可减弱乳腺癌细胞MCF7增殖能力、抑制增殖标记蛋白Ki-67和PCNA表达、降低乳腺癌MCF7细胞迁移、下调迁移标记蛋白VEGF和MMP-9的表达。进一步研究发现干扰BCYRN1还会抑制MCF7荷瘤小鼠肿瘤的生长，降低肿瘤组织增殖标记蛋白Ki-67和迁移标记蛋白MMP-9表达。综上所述，RNA干扰BCYRN1对乳腺癌细胞MCF7和荷瘤小鼠具有抗增殖和转移的作用，下一步，我们计划通过生物信息学手段预测BCYRN1的下游靶基因，探索相应的信号通路以提高乳腺癌治疗的精准性。
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