0 引言

神经降压素（neurotensin, NT）是一种人体广泛分布的神经内分泌肽，NTSR1（neurotensin receptors 1, NTSR1）为NT的特异性高度亲和受体。近来研究发现，NT/NTSR1在多种恶性肿瘤中高表达，我们的前期研究也显示：胃癌组织中NTSR1表达明显高于癌旁正常胃组织；NTR1过表达与胃癌的组织分级、T分期、TNM分期及淋巴结转移呈密切正相关性；NTSR1高表达是独立的预后性指标^[1]。在肠癌、肺癌、前列腺癌中，NTS/NTSR1可诱导介导EGFR信号的激活，从而促进癌细胞分裂、增殖及生长^[2]。人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）也是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）家族的重要成员之一，有研究发现，在肺癌中，持续性刺激NTSR1可导致EGFR及HER2过表达与活化^[3]。

本研究旨在探讨NTSR1基因对胃癌的增殖侵袭的影响，并初步探讨19种Cancer Phenotype信号通路中相关基因（包括EGFR、HER2）在其中的作用，为NTSR1在胃癌发生发展中的作用机制研究进一步提供理论基础。

1 资料与方法 1.1 临床资料

收集无锡市人民医院病理科2011年1月—2012年2月233例经手术切除的侵犯黏膜下层或更深层次胃腺癌的标本。采用10%福尔马林固定标本，常规石蜡包埋，切片，并HE染色。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色采用Envision二步法，DAB显色。NTSR1及EGFR定位于细胞质，HER2定位于细胞膜。NTSR1按瘤细胞阳性率计分：阳性细胞 < 10%为阴性（-），10%~50%为阳性（+），≥50%为强阳性（++）^[4]。参考文献，将EGFR染色半定量评分分为：0、+、++和+++，+~+++视为阳性^[5]。HER2染色半定量评分分为：0、+为阴性，++为弱阳性，+++为强阳性^[6]。

1.2.2 细胞培养

将人胃癌细胞株（AGS、MGC-803、SGC-7901、MKN-45及MKN-74）在含10%胎牛血清的DMEM完全培养液中常规培养，培养条件为湿润状态下37℃、5%CO₂。

1.2.3 NTSR1

shRNA慢病毒载体的构建和转染慢病毒载体介导的靶向NTSR1的shRNA和对照control-shRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，针对3条NTSR1 Target序列，最终选用Target序列为CACCGTCAAGGTCGTCATA，以无靶点的基因序列为阴性慢病毒对照，载体框架结构为hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，构建和包装慢病毒。处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养液制成每毫升（3~5）×10⁴个细胞悬液，继续培养保证感染时铺板量达到15%~30%左右。感染后10 h更换为常规培养液继续培养。病毒滴度为1E+9 TU/ml，病毒用量4 μl，感染MOI=20，感染时细胞密度/孔为20%，保证感染效率达到80%左右，用于检测下游癌细胞的增殖及侵袭等细胞功能实验。实验分为三组：正常目的细胞（MOCK组）、加阴性对照病毒感染的细胞组（NC组）及加NTSR1基因shRNA病毒感染的细胞组（KD组）。

1.2.4 实时荧光定量PCR技术

NTSR1上游引物序列：GTCAAGGTCGTCATACAG；下游引物序列：GATGATGGTGTTCAGGAC（产物片段为81 bp），以GAPDH作参照。扩增体系12 μl：SYBR premix ex taq 6.0 μl，引物mix（5 μmol/L）0.3 μl，模板（反转录产物）0.6 μl，RNase-Free H₂O 5.1 μl。反应条件：95℃ 30 s（1个循环）。95℃ 5 s，60℃ 30 s（40个循环）。95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s（1个循环）。结果判定：相对定量，F=2-∆∆Ct，ΔCt=Ct_目的基因-Ct_内参基因；-ΔΔCt=ΔCt_{NC组平均值}-ΔCt_各样品；2-ΔΔCt反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平，当ΔCt值≤12时，该细胞中基因表达丰度为高；当1ΔCt值为12~16时，该细胞中基因表达丰度为中；当ΔCt值≥16时，该细胞中基因表达丰度为低。

1.2.5 噻唑蓝（MTT）法

取对数生长期的癌细胞常规消化，接种于96孔板，接种量为每孔2 500个细胞（100 μl）。每24 h检测1次肿瘤细胞的相对生存力，酶标仪490/570 nm检测OD值，连续检测5 d。（OD₄₉₀反映具有活力的细胞的数量，OD₄₉₀/fold为各实验组d1~d5相对d1的OD₄₉₀倍数，表示各天的增殖倍数）。

1.2.6 细胞侵袭实验（使用Corning侵袭试剂盒）

本试剂盒嵌入物含有8 µm孔径大小的聚碳酸酯膜，其上方是Matrigel基质的薄层，与体内侵袭转移能力有较好的相关性。收集对数生长期的各组细胞，用无血清培养液将细胞密度调整成1×10⁵个/孔（24孔板），接种于小室上部，在下面小室中加入750 µl 30%FBS培养液。37℃培养24 h。待培养时间结束后将上室的附着细胞用棉拭子擦去，滴2~3滴Giemsa染色液到膜的下表面染色转移细胞3~5 min后，将小室浸泡冲洗数次，空气晾干。显微镜拍照：每个小室，随机选取视野（×200），拍照计数。

1.2.7 PathScan组织芯片检测Cancer Phenotype信号通路中相关基因

按照说明书，安装检测装置，每个孔先加入100 μl封闭液，移除后，加入细胞裂解样品50 μl，4℃过夜。移除细胞裂解样品后清洗。加入75 μl的1×抗体检测混合液，孵育1 h。移除后清洗。加入75 μl的1×HRP-链接的链霉亲和素，孵育0.5 h。移除后清洗。拆解装置，将玻片浸入1×清洗液中。化学发光成像系统（CLINX ChemiScope 5300）曝光1~2 s。阵列靶标分布、基因及调节位点说明，见图 1。

1.3 统计学方法

本研究应用SPSS 18.0软件包进行统计学分析，相关性检测采用Spearman分析。计算均数和标准差，以均数±标准差（x± s）表示，量的比较采用T-Test法检验，概率P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 NTSR1与EGFR及HER2的关系

经免疫组织化学检测，233例胃癌组织中NTSR1阳性表达与EGFR及HER2表达均存在显著正相关性（均P < 0.05），见表 1，NTSR1阳性表达情况，见图 2。同时EGFR与HER2两者表达亦存在显著正相关性（P < 0.05），见图 3、表 2。

2.2 Real-time PCR检测5种胃癌细胞系的NTSR1表达分析

结果显示NTSR1在MKN-45中的表达丰度为高，在SGC-7901中的表达丰度为中，在MKN-74、AGS、MGC-803中的表达丰度为低，故以MKN-45作为研究对象，见表 3、图 4。

2.3 MKN-45细胞的sh NTSR1转染效率

于转染96 h后开始荧光显微镜观察，MKN-45细胞的转染效率为80%以上，见图 5。

2.4 NTSR1对胃癌细胞株体外增殖能力的影响

MTT检测结果表明：转染后第1~5天，转染shNTSR1的MKN-45细胞增殖速度比对照组明显减慢，经T-Test分析其差异具有统计学意义（P=0.000），见图 6。证明NTSR1能显著促进MKN-45细胞的增殖。

2.5 NTSR1对胃癌细胞株体外侵袭能力的影响

通过计算侵袭转移细胞数，转染shNTSR1的MKN-45细胞实验组孵育48 h后侵袭小室内的转移细胞数与对照组相比明显减少，差异具有统计学意义（P=0.0035），见图 7。证明NTSR1能促进MKN-45细胞的侵袭转移。

2.6 NTSR1对胃癌细胞株Cancer Phenotype信号通路中相关基因的影响

在MKN-45细胞中，RNA干扰NTSR1基因后，检测Cancer Phenotype信号通路中相关基因，其通路中p27^Kip1蛋白的表达水平显著上调，同时，EGFR、HER2、EpCAM及Met也有较明显的下调趋势，见图 8。

3 讨论

本研究为明确NTSR1是否作用于胃癌细胞增殖及侵袭转移和可能的机制，选择高表达NTSR1胃癌细胞系MKN-45细胞，并建立稳定的NTSR1 shRNA胃癌细胞株，当NTSR1表达下调后，胃癌细胞的增殖倍数明显减慢，侵袭转移能力亦显著减弱，表明NTSR1能促进胃癌细胞的增殖及侵袭转移；进一步检测Cancer Phenotype信号通路中的19种相关基因（包括EGFR及HER2）表达发现，NTSR1表达下调后，p27^Kip1蛋白表达显著上调，同时，EGFR、HER2、EpCAM及Met也有较明显的下调趋势，提示NTSR1可能是通过调控这几个基因的表达，以实现其在胃癌发生发展中的作用。

研究发现，NT/NTSR1可激活EGFR促进癌细胞分裂及生长。在结肠癌细胞系中，NT激活MAPK、Akt磷酸化及EGFR-MMPs活化^[2]。NT可引发释放EGF样配体，与EGFR结合，激活下游MAPKs或PI3K/Akt介导信号通路，进一步磷酸化ERK1/2和Akt，从而作用于各种生长转录因子，调节细胞周期或增殖^[7]，或依赖PLC/PKC途径，使EGFR蛋白的Tyr845磷酸化，导致Stat5b转录或MAPKs通路的持续激活。NTSR1和EGFR系统之间通过放大一个共同的下游信号通路或者通过EGFR直接活化实现^[8]。Younes等^[3]研究肺癌发现，持续性刺激NTSR1使EGF样配体激活，导致自分泌或旁分泌性EGFR家族的结构激活，从而使EGFR、HER2与HER3过表达与活化。但三者的转录水平并没有改变，表明三者的合成-降解体系循环平衡在NT的作用下发生了变化，过表达的HER2胞内区域阻碍了活化的EGFR进入笼形蛋白包裹的小泡，并限制磷酸酶活性，使EGFR/HER2胞吞作用受损，溶酶体靶向作用也显著减弱，活化EGFR返回细胞表面的循环加快，EGF配体离解减少，使EGFR信号得以持续维持。本研究的免疫组织化学检测发现，NTSR1与EGFR/HER2之间存在显著正相关性，EGFR与HER2之间亦存在显著正相关性，干扰NTSR1基因表达后，EGFR及HER2蛋白表达均较明显减弱，说明NTSR1基因可能作用于后两者的表达，HER2和EGFR共表达形成异源性二聚体时，具有更高的再利用率、稳定性和转导信号的能力，本研究显示，EGFR和HER2可能共同参与了NTSR1对胃癌增殖侵袭的作用。

NTSR1基因与p27^Kip1、EpCAM、Met的相关性还未见报道。在本研究中，p27^Kip1表达显著受控于NTSR1表达。p27^Kip1（p27或kip1）是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白（CKI）家族成员之一，主要抑制细胞周期蛋白E（Cyclin E）-周期蛋白依赖性蛋白激酶2（CDK2）激酶复合物的生物活性，使细胞不能通过G₁/S调控点，停滞于G₁期，从而抑制细胞增殖^[9-10]。p27阳性率降低与胃癌的进展期、浸润深度以及淋巴结转移有显著相关性^[11]。EpCAM是一个细胞黏附分子，还参与细胞信号转导、细胞迁移、增殖和分化^[12]，也是一个肿瘤干细胞标志物，EpCAM蛋白的表达强度与胃癌的肿瘤部位、肿瘤大小、Lauren分型、浸润深度、淋巴结分期、TNM分期、淋巴结转移和远处转移密切相关，并与胃癌的生存率呈负相关性，siRNA下调EpCAM表达将显著抑制体外胃癌细胞的黏附、侵袭和迁移能力及体内胃癌细胞的转移能力^[13-14]。c-Met为肝细胞生长因子受体，具有酪氨酸激酶活性，具有很强的促细胞增殖，诱导上皮细胞和成纤维细胞离散和运动的作用。它参与细胞信号转导、细胞骨架重建等，是调节细胞增殖、分化和修复过程的一个重要因子。胃癌组织中c-Met表达率较高，和胃癌侵袭、转移及预后差有关，c-Met信号活化主要是通过基因扩增导致过表达及激酶活化。约4%~10%的胃癌存在c-Met基因扩增，约50%的进展期胃癌存在c-Met过表达，而活化性c-Met基因突变很少见，其激活机制较复杂。c-Met信号激活与HER2靶向治疗的耐药也存在关联^[15-16]。事实上，p27^Kip1、EGFR、HER2、EpCAM及Met之间也存在着千丝万缕的联系^[17-18]，NTSR1基因可能是通过多维度作用于多种信号因子影响胃癌的增殖侵袭，但仍需要进行深入细致的进一步研究。

综上所述，NTSR1与胃癌的发生及侵袭转移密切相关，其可能是通过多维度调控下游信号因子（如EGFR/HER2、p27^Kip1、EpCAM及Met）来参与胃癌的发生、增殖、侵袭、转移等过程。NTSR1可能是一个有效的靶向位点，NTSR1在肿瘤中过表达，靶向抑制可能主要抑制其有害的功能，从而有效减轻靶向治疗的不良反应，有可能为胃癌治疗开辟一条新途径。