2018, Vol. 45文章信息
- 黄芪多糖对气阴两虚Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长、转移及细胞周期的影响
- Effects of Astragalus Polysaccharides on Growth, Metastasis and Cell Cycle of Lewis Lung Cancer in Tumor-bearing Mice with Qi and Yin Deficiency
- 肿瘤防治研究, 2018, 45(3): 131-137
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2018, 45(3): 131-137
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2018.17.0220
- 收稿日期: 2017-07-03
- 修回日期: 2017-12-27
引用本文 |
2. 730000 兰州，甘肃中医药大学，甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室
2. Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Provincial Key Laboratory of Molecular Medicine and Chinese Medicine Prevention and Treatment of Major Diseases in Gansu Province, Lanzhou 730000, China
目前，肺癌已列为恶性肿瘤死亡的首位死因，5年生存率不到15%[1]。化疗是肺癌常规治疗方法之一，但化疗药物的副作用使患者免疫功能受到抑制，影响其生活质量，有些患者甚至不能耐受而中断治疗。肺癌的临床证型有气滞、血瘀、痰湿、热毒等，目前大多数肺癌患者屡经手术、放疗、化疗的损伤，加速了气虚、阴虚的形成与发展，以虚证、虚实夹杂证多见，而虚证则是以气阴两虚证为多见。甘肃道地药材黄芪可抗辐射损伤，有升高小鼠脾、胸腺指数等功效[2]，其天然有效活性成分黄芪多糖（Astragalus polysaccharide, APS）可以抑制肿瘤的生长，增加肿瘤患者机体细胞免疫功能，改善生活质量[3]，是传统扶正固本的中药。本课题组前期工作已初步表明APS能降低小鼠Lewis肺癌移植瘤CD44的表达，减少血清Ⅳ型胶原蛋白（collagen type Ⅳ, Col4）和透明质酸（hyaluronic acid, HA）的含量[4]，本实验体外培养Lewis肺癌细胞，用碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色法通过流式细胞术检测细胞周期；体内建立气阴两虚Lewis肺癌移植瘤小鼠模型，观察不同浓度APS与顺铂（cisplatin, DDP）联合作用后抑瘤率、免疫功能、细胞因子水平，研究APS作为抗癌辅助药对化疗药物的抗瘤增效作用。
1 材料与方法 1.1 瘤株及动物Lewis肺癌细胞（Lewis lung cancer cell, LLC）由甘肃中医药大学中西医结合实验中心提供；SPF级6~8周龄的C57BL/6J小鼠90只，雌雄各半，体质量18~20g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2015-25。
1.2 药物及试剂麻黄、细辛、制附子、天南星各27 g，购自甘肃中医药大学附属医院，水煎浓缩到1 g/ml；黄芪多糖，兰州博惠斯生物科技有限公司，批号：Hqdt150121，用0.9%氯化钠溶液将黄芪多糖稀释成1 mg/ml溶液；顺铂：每支20 mg，云南个旧药业生物有限公司，批号：151507，用0.9%氯化钠溶液把顺铂稀释成0.12 mg/ml溶液，4℃存放。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）、HyClone High Glucose DMEM、胎牛血清（苏州北纳创联生物技术有限公司，批号NVJ0929、NYE1586）；胰蛋白酶（美国Gibco公司，批号20150808225）；血清IL-2、TNF-α、IL-10、IFN-γ ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号2015925、2015526、2015651、2015454）；血清HIF-1α、VEGF、MMP-2 ELISA试剂盒（美国RD公司）。
1.3 仪器新苗牌超净工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司）；AR224电子天平（大连格瑞莱仪器有限公司）；BC-J80S CO2细胞培养箱（上海博迅生物仪器有限公司）；DMIL-RF1荧光倒置相差显微镜（重庆光电仪器有限公司)；MEK-6318型全自动血细胞分析仪（日本光电株式会社）；超速离心机（金坛市恒丰仪器厂）；流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）以上仪器由甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究重点实验室提供。
1.4 实验方法 1.4.1 细胞培养常规培养LLC于10%新生胎牛血清（含100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）DMEM培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养，隔天换液，每3天用胰蛋白酶消化，以1:3比例进行细胞传代，取对数生长期细胞进行实验。
1.4.2 流式细胞仪检测细胞周期对数生长期LLC接种于6孔板使每孔细胞数为5×104个，随机分组，空白组加入等体积的DMEM培养液，中药组分别加入黄芪多糖使终浓度为25、50、100、200、400 μg/ml，每组设3个复孔，常规继续培养48h后消化细胞，离心去上清液，收集各组细胞后冷PBS洗2次加入预冷的70%乙醇制备成单细胞悬液，4℃固定过夜，检测前，再离心、弃上清液，PBS洗后PI染液避光染色，孵育30 min，上机检测。
1.4.3 制备模型、分组及给药90只C57BL/6J小鼠随机分为9组，空白组、模型组，APS低、中、高剂量组，联合用药低、中、高剂量组，DDP组，每组10只；除空白组以外，其余各组按文献[5]方法造模，小鼠给予温热性中药灌胃，0.4 ml每只，同时放置于密闭的玻璃箱中刨花烟熏，30 min每次，1次/天，小鼠自然吸入，连续10 d；并将对数生长期的LLC悬液接种于造模小鼠右腋皮下，每只0.2 ml（0.2%锥虫蓝染色后计数，活细胞数 > 95%，浓度为1×107/ml），全程无菌操作，接种后第7天，造模小鼠右腋下均可触及瘤块，造模过程中小鼠无死亡，即气阴两虚Lewis移植瘤小鼠动物模型建立成功；动物给药剂量按照《中药药理研究方法学》[6]，以人与小鼠体表面积折算等效剂量得出小鼠的实验灌胃剂量，各药物干预组均从造模后第1天开始给药，空白组、模型组灌胃0.9%NaCl 0.3 ml，低、中、高剂量组灌胃APS 50、100、200 mg/kg，DDP组腹腔注射DDP 6 mg/kg，联合用药低、中、高剂量组APS各剂量同上，DDP腹腔注射3 mg/kg，DDP每周一次，中药1次/天，连续21 d，各组小鼠10只，雌雄各半，分笼饲养，均饲养于20℃~24℃、相对湿度70%~80%、自由饮水、摄食条件下。
1.4.4 抑瘤率的检测接种后第7天，每隔3天用游标卡尺测量腋下肿瘤最大长径（a）和短径（b），计算肿瘤体积，平均瘤体积=a×b2/2；肿瘤精确称重量，计算抑瘤率，抑瘤率=（1-用药组肿瘤平均重量/空白组肿瘤平均重量）×100%。
1.4.5 免疫指标检测ELISA法检测血清IL-2、TNF-α、IL-10、IFN-γ，HIF-1α、VEGF、MMP-2含量，严格参照试剂盒说明进行检测。
1.4.6 血液细胞、骨髓细胞测定小鼠第21天称量体重并脱颈处死，眼球摘取采血，采用血细胞分析仪检测白细胞、红细胞、血小板数量；剪开一侧股骨两端，3%醋酸溶液冲洗骨髓腔，以每根股骨中的骨髓细胞表示结果，白细胞记数板计数。
1.4.7 药物联合用药协同效应评价联合用药效果按金氏公式评价[7]：q值=Ea+b/Ea+Eb–Ea×Eb，Ea+b为两药合用的抑瘤率，Ea、Eb为两药物单用的抑瘤率，q > 1.15表示两药物作用协同；q < 0.85表示两药物作用相互拮抗；q为0.85~1.15时表示两药物作用相加。
1.5 统计学方法数据分析用SPSS 17.0统计学软件进行，结果均用（x±s）表示，组间数据进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 黄芪多糖对LLC周期的影响黄芪多糖在100~400 μg/ml时，可以显著提高LLC在S期的比例，而降低其处于G1、G2/M期的比例，LLC的S期细胞从20.7%升高到56%，而G1期细胞从61.2%降低到38.8%，G2/M期细胞从18.1%降低到5.2%，但在黄芪多糖高于100 μg/ml时变化才比较明显。药物组除25、50 μg/ml外，100、200、400 μg/ml组与空白组比较差异有统计学意义（P < 0.01），提示LLC发生S期阻滞，从而说明了黄芪多糖可诱导LLC发生凋亡，结果见图 1、表 1。
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| 图 1 不同浓度黄芪多糖处理Lewis肺癌细胞后细胞周期分布图 Figure 1 Cell cycle distribution of Lewis lung cancer cell(LLC) treated with different concentrations of astragalus polysaccharide(APS) |
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造模后小鼠第3天各组右腋下注射部位未触及包块，第7天开始，右腋下接种部位均可触及瘤块，造模成功率为100%，皮下肿瘤大小不一，初起可活动，逐渐变硬，后期部分小鼠肿块表面出现局部溃破，影响正常活动；空白组小鼠呼吸平稳，皮毛黑亮、顺滑，饮食正常，活泼好动，体重渐增；模型组毛发脱落、竖立、无光泽，咳嗽、气短喘促、神疲乏力、饮食减少，体重下降；顺铂组一般情况较差，精神萎靡，食少易惊，团缩拱背，毛发稀疏、暗淡，体质量降低最快，中药高剂量组及联合用药各组各个症状有所好转，气促减轻，毛发顺滑，活动能力增强，体质量降低较缓慢。
2.3 各组气阴两虚Lewis肺癌移植瘤小鼠肿瘤体积、瘤重、抑瘤率不同剂量APS均可抑制体内肿瘤的生长，APS中、高剂量组、DDP组及联合用药各组与模型组比较差异有统计学意义，联合用药各组与DDP组比较差异有统计学意义（P < 0.01)；联合用药各组的抑瘤率高于APS各组和顺铂组，q值均在0.85~1.15之间，中药联合化疗可提高抑瘤率，表现为作用相加，见表 2。
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与模型组比较，APS高剂量组、联合用药中、高剂量组小鼠各细胞数量均显著升高，DDP组各细胞数量均显著降低（P < 0.05, P < 0.01）；与DDP组比较，联合用药组各细胞数量显著升高（P < 0.01），提示APS对气阴两虚Lewis肺癌移植瘤小鼠顺铂化疗所致的外周血细胞及骨髓细胞的损伤，有一定的保护作用，见表 3。
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与空白组比较，模型组IL-2、INF-γ、TNF-α含量均显著降低；IL-10、HIF-1α、VEGF、MMP-2含量均显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，DDP、APS中、高剂量及联合用药各组IL-2、INF-γ、TNF-α含量均显著升高，IL-10、HIF-1α、VEGF、MMP-2含量均显著降低（P < 0.05，P < 0.01）；与DDP组比较，联合用药各组IL-2、INF-γ、TNF-α含量均显著升高，IL-10含量显著降低，联合用药中、高剂量组HIF-1α、VEGF、MMP-2均显著降低（P < 0.01），见表 4、表 5。
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现代研究证明“机体的免疫力决定着肿瘤的发生、发展”，这与中医的“正虚致瘤”的观点是一致的。中医学认为肺癌的病理机制表现为“正虚邪实”，正虚贯穿于肿瘤发生、发展的始终[8]。如手术后的肺癌患者，由于手术造成失血、进而耗气伤津，大多表现为气阴两虚；接受放疗的肺癌患者，由于放射线为“热毒”之邪，津液耗伤，大多表现为阴虚内热；接受化疗的肺癌患者，由于“药毒”损伤脏腑气血，骨髓抑制，血细胞减少，胃肠道反应，机体免疫力下降，其不良反应在中医表现为“气血津液损伤”，所以气阴两虚贯穿于肺癌疾病的始终，临床肺癌患者免疫功能下降。中药黄芪具有补气升阳，益卫固表，托疮生肌等功效；黄芪多糖是其主要有效活性成分，可抗病毒、抗肿瘤、激活巨噬细胞、NK细胞、增加细胞因子的分泌量、活化淋巴细胞，对细胞免疫、体液免疫有很大影响[9-10]。研究证明，APS可诱导人胃癌MKN45细胞发生凋亡[11]；对于NSCLC晚期的患者，APS能够明显提高生存质量[12]；APS对肝癌BEL-7404细胞有杀伤作用，与顺铂联合有协同作用。因此，重视扶正治疗，辨证采用“补法”调节肺气，体现了中医扶正治疗的原则。本实验结果中，APS高剂量组、联合用药中、高剂量组小鼠各细胞数量均显著升高，提示APS能保护骨髓造血功能，减轻化疗不良反应，有利于保证临床化疗方案的正常实施。
本实验根据文献方法[5]给小鼠“刨花烟熏”、灌服温热性中药并采用腋下移植Lewis肺癌细胞制备气阴两虚荷瘤动物模型。温热性中药由麻黄、天南星、制附子、细辛四味组成。麻黄性温，发汗解表，发汗日久津血耗伤，气随津而散，血汗同源致使肺气阴损伤；天南星辛、苦、温燥，《本草汇言》记载“阴虚血少、血热血燥之人不可用也”；制附子、细辛，性温，温阳、通窍，伤阴耗气。综上所述，四味中药归肺经，性温，耗气伤津、伤阴，所以作为肺气虚、肺阴虚动物造模用药。
细胞周期的异常调控在肿瘤发生的过程中起重要作用[13]，许多抗肿瘤的药物可通过影响细胞周期的某个时期使细胞增殖受阻，从而诱导其凋亡[14]。细胞周期有3个调控点，即：G0/G1、G1/S、G2/M，其中G1/S期和G2/M期转换最为重要[15]。本实验结果显示APS对LLC作用48 h后，G1、G2/M期细胞的细胞百分率逐渐降低，S期细胞的百分率逐渐升高，提示细胞发生S期阻滞，这可能是黄芪多糖抑制LLC增殖的机制之一。
IL-2是一种免疫增强剂，可以增强机体的免疫功能；IFN-γ可通过血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）基因转录发挥其抑制肿瘤血管生长的作用[16]；目前有研究显示：IL-2、IFN-γ与T淋巴细胞增殖、分化、成熟有关，可以增强NK细胞的杀伤活性[17]。TNF-α能够激活T细胞、刺激B细胞产生抗体，促进白细胞杀死微生物。TNF-α使血管丰富的肿瘤细胞发生明显的坏死和生长抑制，并参与机体的炎性反应与免疫应答，具有抗肿瘤作用[18]；IL-10能降低NK细胞活性，抑制巨噬细胞抗原提呈能力，逃避免疫监视和促进肿瘤细胞的生长；IL-10还可以增高引流淋巴管肿瘤的数量和抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤的转移[19]。本实验结果中模型组小鼠血清IL-10含量升高，IL-2、INF-γ、TNF-α含量降低，而各治疗组IL-2、INF-γ、TNF-α含量升高，IL-10含量降低，与顺铂组相比，联合用药各组作用更明显，提示APS联合顺铂能够显著地改善顺铂所导致的免疫力低下小鼠的免疫功能，抑制肿瘤细胞进一步发展。
缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）是一种氧依赖性的转录因子，缺氧环境可促进HIF-1α基因在肿瘤细胞表达升高，增加了肿瘤血管生成和瘤细胞的转移，预后不良[20-21]。VEGF是现在已知作用最强的肿瘤细胞血管生长的调控因子，一旦与其受体结合，就会使血管内皮细胞分裂、增殖并进行迁移，这样有利于促进肿瘤新生血管的形成；VEGF表达量的增加与肿瘤的生长、转移有密切的关系[22-23]。蒋晓东等[24]研究报道：在正常组织中VEGF均无表达，仅在肿瘤细胞中表达。HIF-1α的高表达可上调VEGF基因表达，VEGF是HIF-1α的重要靶基因[25]，左顺庆等[26]研究发现非小细胞肺癌中HIF-1α与VEGF表达正相关。基质金属蛋白酶（matrix metalloprotinases, MMPs）是分解细胞外基质组分的一类锌蛋白酶，MMP-2是MMPs家族中的一种，能降解基质、胶原蛋白，突破基质屏障、进一步促进肿瘤细胞的侵袭和转移，还可通过毛细血管内生成和新生血管生成等方式，进一步增强瘤细胞的生长与扩散。有研究表明，MMP-2在肺癌组织细胞中的水平显著升高，其水平与肿瘤细胞的生长、进展、转移、预后有密切的关系[27]。本实验结果显示：与模型组比较，各药物治疗组小鼠血清HIF-1α、VEGF、MMP-2的水平均降低，与顺铂组比较，联合用药中、高剂量组作用更明显，推测APS联合顺铂可能通过下调HIF-1α、VEGF、MMP-2的表达降低肿瘤细胞新生血管生成，而发挥抑制肿瘤生长、复发的作用。
综上所述，APS在体外对LLC有抑制作用，将细胞周期阻滞在S期，体内与顺铂联合能有效抑制气阴两虚Lewis肺癌移植瘤小鼠肿瘤细胞生长，降低肿瘤细胞新生血管的生成和改善化疗药物顺铂所导致的免疫力低下小鼠的免疫功能，表明APS与顺铂联合使用增加了对LLC的抑瘤效果，减少了化疗中的不良反应。
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