0 引言

肺癌（Lung cancer）是世界上发病率和死亡率最高的肿瘤。据世界卫生组织最新报道，每年超过110万人死于肺癌，占所有癌症死亡人数的17.8%^[1-2]。其中小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）的发病率约占全部肺癌的20%~25%，SCLC的治疗以化疗为主，虽然SCLC患者早期对一线化疗方案敏感，但极易出现多药耐药（multidrug resistance, MDR）现象而导致治疗失败^[3]，因此，SCLC的多药耐药已成为目前临床亟待解决的难题。

前期预实验通过LncRNA芯片发现长链非编码RNA AC010145.4在SCLC耐药细胞株中的表达较化疗敏感细胞株明显增高，提示LncRNA AC010145.4可能与SCLC的耐药相关，然而关于LncRNA AC010145.4在SCLC中的表达及意义目前国内外尚未见相关报道。本研究应用实时荧光定量PCR法检测LncRNA AC010145.4在SCLC组织及其对应的癌旁组织或正常肺组织中的表达情况，分析其表达与患者临床病理特征间的关系，探讨LncRNA AC010145.4在SCLC疗效及预后评估中的潜在作用。

1 资料与方法 1.1 病例资料

收集2012年1月至2016年12月在成都市第七人民医院肿瘤科、胸外科及呼吸内科进行手术、穿刺活检或支气管镜活检的SCLC组织标本67例。其中27例是手术后SCLC原发灶及相应的癌旁组织（距离癌组织≥2 cm），40例未行手术治疗SCLC患者的癌组织取自支气管镜或CT引导下的穿刺活检标本，收集同期40例因各种原因导致肺外伤的正常肺组织标本作为阴性对照组。所有患者的病例资料完整，手术前均未接受过放化疗。67例SCLC中，男37例、女30例；年龄为33~76岁，平均年龄为（52±6.0）岁；局限期29例、广泛期38例；淋巴结转移者42例、无淋巴结转移者25例；远处转移者38例、无远处转移者29例。67例患者均接受以铂类为主的化疗，首先给予一线化疗方案（依托泊苷+铂类）化疗；出现耐药后，给予二线化疗方案（伊立替康+铂类）。其中化疗敏感者（化疗4~5周期后肿瘤缩小30%以上或消失）26例、化疗耐药者（化疗4~5周期后肿瘤增大30%及以上或出现新的转移灶）41例；41例耐药者给予二线化疗方案治疗，所有患者原发灶及淋巴引流区均接受了X线放疗（放疗剂量4500 cGy/30 F，10 F/W）。本研究经成都市第七人民医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 随访

所有患者出院后都进行了随访，主要以电话和门诊进行随访，随访内容包括一般情况、临床症状及影像学检查（胸腹部CT、浅表淋巴结彩超）。随访起点为手术或病理活检日期，随访时间为2~60月，中位随访时间为37月，随访截止日期为2017年2月20日。至随访结束，存活28例，死亡39例。无失访病例。

1.3 材料与试剂

应用TRIzol（美国Invitrogen公司产品）试剂提取SCLC组织、癌旁组织及正常肺组织标本中的总RNA。将提取的总RNA，参照AMV反转录试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司产品）说明书提供的方法将其反转录成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix（宝生物工程（大连）有限公司产品），以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR反应条件：95℃ 10 min；（95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s）×40个循环。以2^-ΔΔCt值表示LncRNA AC010145.4的表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对研究的数据结果进行统计分析。计量资料以（x±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用χ²检验，Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线，并进行Log rank检验；单因素及多因素分析影响SCLC预后的因素。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 LncRNA AC010145.4在SCLC组织中的表达

实时荧光定量PCR检测LncRNA AC010145.4在SCLC组织中的表达，结果显示，SCLC组织中LncRNA AC010145.4的平均表达水平（7.225±1.840）显著高于癌旁组织（1.480±0.590）及正常肺组织（1.290±0.660），差异有统计学意义（F=28.06, P < 0.001），见图 1A。进一步分析发现LncRNA AC010145.4在耐药患者中的表达明显高于化疗敏感者，差异具有统计学意义（t=6.303, P < 0.001），见图 1B。

2.2 LncRNA AC010145.4的表达与SCLC患者临床病理特征的关系

根据LncRNA AC010145.4平均表达水平（7.225）将67例SCLC患者分为高表达组（LncRNA AC010145.4≥7.225）36例及低表达组（LncRNA AC010145.4 < 7.225）31例，分析LncRNA AC010145.4表达与患者临床病理特征的关系，结果发现，LncRNA AC010145.4表达与患者的年龄、性别、吸烟无关（均P > 0.05），而与疾病分期、淋巴及远处转移、化疗敏感度及患者的生存状态明显相关（均P < 0.05），见表 1。

2.3 Kaplan-Meier法分析LncRNA AC010145.4表达与SCLC患者生存时间的关系

采用Kaplan-Meier法绘制SCLC患者的无进展生存及总生存曲线，结果发现LncRNA AC010145.4高表达患者的无进展生存时间（10.45±1.90）月短于低表达者的（22.30±2.45）月，差异有统计学意义（χ²=46.94, P < 0.001）；LncRNA AC010145.4高表达患者的总生存时间（23.00±3.50）月短于低表达者的（36.63±2.90）月，差异有统计学意义（χ²=18.67, P < 0.001），见图 2。

2.4 单因素及多因素分析影响SCLC患者预后的因素

单因素分析发现，疾病分期、淋巴转移、远处转移、化疗敏感度、LncRNA AC010145.4表达与SCLC患者的OS有关（均P < 0.05）；多因素分析结果显示，疾病分期、远处转移、化疗敏感度、LncRNA AC010145.4表达是SCLC患者预后的独立影响因素（均P < 0.05），见表 2。

3 讨论

肺癌的死亡率位居各种恶性肿瘤的前列，发病率也逐年上升。SCLC占原发性肺癌的15%~20%^[4]。由于其生长迅速、早期转移和高度侵袭性，预后较差^[5]。SCLC以全身化疗为主，也可联合放疗和手术^[6-7]。早期SCLC患者对化疗和放疗都非常敏感，但极易产生耐药和放疗抵抗，导致治疗失败，其具体的作用机制尚未完全阐明。

在早期的肿瘤研究中，人们的注意力主要集中在蛋白编码基因在肺癌发病机制上。近年来的研究发现，在人类基因组的转录本当中，大约只有2%的基因具有编码蛋白能力，与此同时，90%以上的基因并不具备编码蛋白的能力，他们往往被转录成非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA），这些ncRNAs发挥的基因调控作用在肺癌的发生、发展过程中发挥着重要的作用^[8-9]。

LncRNA是一类转录本长度超过200 nt的ncRNA，LncRNA一度被认为仅仅是RNA聚合酶Ⅱ转录时的副产物，是基因转录时的“噪音”和“垃圾”，并不具有特定的生物学功能，是一个“暗物质”。然而，近年来的研究发现，LncRNA在多种类型肿瘤细胞（包括肺腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等）的增殖、克隆、凋亡、侵袭、转移及耐药等方面均发挥着重要作用，越来越多的LncRNA在基因调节等方面的功能被揭示出来^[10-12]。LncRNA有望成为新的肿瘤标志物和肿瘤治疗靶点，在肿瘤诊断和治疗方面显示出良好的临床应用前景。近年来研究发现，转移相关肺腺癌转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）作为早期肺腺癌患者预后的一个独立预后标志物，是第一个在肺癌中被研究的LncRNA^[13]。HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA, HOTAIR）在NSCLC组织中高表达，HOTAIR高表达状态与NSCLC患者的淋巴结转移及临床分级相关，并预示着患者预后相对较差^[14]。结肠癌相关转录因子2（colon cancer associated transcript 2，CCAT2）在NSCLC组织中高表达，其高表达与肺腺癌预后较差相关，提示CCAT2可能是一个肺腺癌特异的LncRNA^[15]。LncRNA生长停滞特异性转录本5（growth arrest-specific transcript 5, GAS5）在NSCLC组织中低表达，其表达水平与NSCLC的肿瘤大小及临床分级有关。LncRNA GAS6-AS1在NSCLC组织中低表达，其表达水平与NSCLC患者的淋巴结转移以及临床分级有关，而且GAS6-AS1是NSCLC患者的一个独立预后标志物^[16]。Niu等^[17]研究发现，牛磺酸调节基因1（taurine upregulated gene 1, TUG1）参与调节SCLC的生长和化疗耐药。LncRNA浆细胞瘤变异易位基因1（plasmacytoma variant translocation 1, PVT1）的上调是SCLC患者预后较差的标志物，参与调节SCLC的侵袭和迁移^[18]。

本研究小组前期通过LncRNA芯片发现，LncRNA AC010145.4在SCLC耐药细胞株中的表达高于化疗敏感细胞株，提示LncRNA AC010145.4可能与SCLC的发生和发展有关。本研究通过实时荧光定量PCR法检测67例SCLC组织、27例癌旁组织及40例正常肺组织中LncRNA AC010145.4的表达，分析LncRNA LncRNA AC010145.4表达与SCLC患者临床病理特征及预后的关系。结果发现SCLC组织中LncRNA AC010145.4的表达水平明显高于癌旁组织及正常肺组织。LncRNA AC010145.4在化疗耐药患者中的表达明显高于化疗敏感者；LncRNA AC010145.4表达与SCLC患者的性别、年龄无关，而与疾病分期、淋巴结转移、远处转移、化疗耐药相关。高表达LncRNA AC010145.4患者的总生存时间及无进展生存时间均短于低表达者。单因素及多因素分析发现LncRNA AC010145.4表达、疾病分期、化疗敏感度和远处转移是SCLC患者独立的预后因素。以上研究结果提示，LncRNA AC010145.4参与调节SCLC的发生和发展，可能作为潜在的SCLC患者疗效及预后评估的生物标志物。然而，影响SCLC预后的分子机制复杂，LncRNA AC010145.4调节SCLC患者预后的具体作用机制及参与的信号通路，尚需进一步研究。