0 引言

随着我国近年来工农业、交通运输业等大力发展以及煤炭石油等能源的大规模开发利用，造成环境污染问题日益严峻。雾霾是空气污染和气象因素共同作用的结果，雾霾天气，大气能见度下降，大气中颗粒物（particulate matter, PM）特别是细颗粒物（PM_2.5）是导致能见度降低的主要因素^[1]。PM粒径≤2.5 μm的称为细颗粒物，即PM_2.5。因PM_2.5粒径细小，相对表面积较大，在大气中停留时间较长，可吸附大量对身体有害的物质，并直接深入细支气管和肺泡形成沉积，对身体造成多种病变，多引起心血管及肺部病变等^[2-4]。大量PM_2.5在肺部沉积造成肺部不同病变，PM_2.5上携带的多环芳烃和重金属成分等具有致细胞突变和致癌性^[5]。本实验对石家庄市空气中PM_2.5致Wistar大鼠肺部病变进行研究，探讨石家庄市空气中PM_2.5是否具有致肺部癌变作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组

Wistar大鼠：购于河北省实验动物中心，生产许可证编号：SCXK（冀）2010-1-003；饲养于河北医科大学第四医院实验动物中心清洁环境，温度：22℃~24℃；湿度：30%~70%；换气次数：15次/小时。

动物分组：实验组：PM_2.5采集器，按抽气量50 L/min，完全PM_2.5富集量，理论PM_2.5浓度为外部空气中PM_2.5浓度的10倍；对照组：正常饲养，大鼠饲养于PM_2.5 < 35 μg/m³的洁净环境中。染毒动物每日染毒4 h，一周染毒5次。每组Wistar大鼠20只，共染毒9月，其余时间与对照组饲养于同一环境中。每日观察大鼠饮食及饮水情况，每周测量大鼠体重。

1.2 主要试剂及仪器

PM_2.5采集器及全身暴露染毒系统（北京慧荣和科技有限公司）；FC500型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；DNA染液（美国BD公司）；大鼠癌胚抗原（CEA）、卵巢癌抗原（CA125）及鳞状细胞癌相关抗原（SccAg）均用ELISA试剂盒检测（北京冬歌生物公司）。

1.3 动物全身PM_2.5暴露系统设备连接及气体流向，见图 1。 1.4 肺组织HE染色

将福尔马林固定的肺组织，常规石蜡包埋，4 μm切片后将组织切片置80℃烤箱1 h，冷却后入二甲苯Ⅰ及Ⅱ各10 min，过梯度酒精后苏木精对比染色3 min，取出后自来水冲洗，盐酸酒精分化，氨水返蓝，伊红染色，过梯度酒精及二甲苯后，中性树胶封片。显微镜下观察。

1.5 Wistar大鼠静脉血CD3、CD4、CD8表达水平

实验结束后，取大鼠静脉血0.5 ml，抗凝，分别取0.1 ml抗凝静脉血加入两个流式样品管中，其中一管加入10 μl CD4-FITC及10 μl CD8-PE抗体，另一管中加入10 μl CD3-FITC抗体，同时设置同型对照组，室温避光放置30 min后裂解红细胞，流式细胞仪检测。

1.6 ELISA实验检测Wistar大鼠血清及肺灌洗液中CEA、CA125及SccAg表达水平

Wistar大鼠血清收集：抽取Wistar大鼠静脉血，促凝后室温放置1 h，以3 000 r/min离心15 min，取上层血清至无菌EP管中，-20℃保存备用。

肺灌洗液收集：将肺完整剥离时带2~3 cm气管，置于冰上的无菌玻璃皿中，注射器抽取5 ml 0.9%氯化钠溶液，将针头插入气管中，用镊子夹闭后将0.9%氯化钠溶液灌入肺中，反复抽吸3次，将抽出灌洗液装入无菌EP管中，-20℃保存备用。

ELISA实验步骤：按试剂盒说明书操作，分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；每孔加入酶标试剂100 μl，用封板膜封板后置37℃温育60 min。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复洗涤5次，拍干。每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μl，终止反应。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15 min内进行。用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.7 网挫法制备肺组织单细胞悬液

将70%乙醇固定的肺组织，用冷0.9%氯化钠溶液冲洗一次，利用网挫法制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/毫升。

1.8 流式细胞术检测Wistar大鼠肺组织细胞凋亡、细胞周期及DNA指数

取制备好的单细胞悬液100 μl，加入0.5 ml DNA染液，4℃冰箱内避光染色30 min，0.9%氯化钠溶液洗涤细胞一次后，加入1 ml 0.9%氯化钠溶液悬浮细胞，流式细胞仪检测。细胞增殖状态以增殖指数（proliferation index, PI）表示，PI=（S+G₂/M）/（G₀/G₁+S+G₂/M）。DNA含量以DNA指数（DNA index, DI）表示，DI=（实验组细胞G₀/G₁期均道值）/（正常细胞G₀/G₁期均道值）

1.9 统计学方法

应用SPSS11.5软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用LSD检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 实验过程中PM_2.5质量浓度

实验利用全身暴露系统进行Wistar大鼠PM_2.5染毒实验，9月的实验，染毒仓内PM_2.5浓度波动较大，但均高于250 μg/m³，见图 2。

2.2 实验过程中Wistar大鼠体质量变化

整个实验阶段，实验组与对照组Wistar大鼠体质量差异无统计学意义，随着实验时间的延长体重呈现稳定增高，见图 3。

2.3 Wistar大鼠肺组织大体观察

实验组正面观，以支气管向外周辐射状颜色发暗，偏黑，多处可见白色斑点和泡状凸起，边缘不规则白色隆起，反面观，有异常白色区，见图 4A~B；对照组正反面观，均呈现均匀粉红色，表面光滑，无明显异常，见图 4C~D。

2.4 肺组织HE染色观察

实验组，肺组织纤维化，肺实变严重，肺泡充血，见大量炎性增生，肺组织中可见大量颗粒性沉着及吞噬了颗粒性物质的巨噬细胞，支气管中的纤毛柱状细胞破坏、管壁纤维化增厚，见图 5A~C。对照组，肺泡完整，肺泡壁正常，未见纤维化、肺实变及肺泡内充血，未见异型增生细胞，见图 5D~F。

2.5 Wistar大鼠静脉血CD3、CD4、CD8表达水平

实验组与对照组相比，静脉血中CD3及CD4阳性细胞增高而CD8阳性细胞降低，但差异均无统计学意义（P值分别为0.792、0.103、0.087）；实验组CD4/CD8比值显著高于对照组CD4/CD8比值（P=0.031），见图 6。

2.6 ELISA实验检测Wistar大鼠血清及肺灌洗液中CEA、CA125及SccAg表达水平

实验组大鼠静脉血及肺灌洗液中CEA及SccAg表达水平高于对照组中的表达，但差异无统计学意义（P值分别为0.495、0.750、0.930、0.667）；实验组大鼠静脉血及肺灌洗液中CA125表达水平显著高于对照组中的表达（P值分别为0.023及0.043），见图 7。

2.7 流式细胞术检测Wistar大鼠肺组织细胞周期

实验组与对照组相比，肺组织细胞周期G₀/G₁期降低而S、G₂/M期及增殖指数增高，但差异无统计学意义（P值分别为0.143、0.286、0.779及0.145），见图 8。

2.8 流式细胞术检测Wistar大鼠肺组织细胞凋亡

结果显示，实验组肺组织细胞凋亡率显著低于对照组细胞凋亡率（P=0.002），见图 9。

2.9 流式细胞术检测肺组织细胞DNA含量

结果显示，实验组肺组织细胞DI值显著高于对照组细胞DI值（P=0.018），提示实验组肺组织细胞DNA含量显著高于对照组（P=0.018），见图 10。

3 讨论

近年来随着我国工农业、交通运输业等大力发展以及煤炭石油等能源的大规模开发利用，造成环境污染问题日益严峻。PM_2.5由于其粒径小，相对表面积大，易富集多环芳烃等有机物、各种重金属等无机物及病原微生物等，并可以随着人的呼吸进入体内导致心血管和呼吸等系统疾病^[6-8]。肺癌因其患病率持续增高且病因复杂，和空气质量的变化密切相关而受到重视。PM_2.5的污染所带来的环境健康效应问题愈来愈严重。虽然PM_2.5与肺癌的关系在流行病学调查中显示有一定的关联，也有一些动物实验研究了PM_2.5与肺部病变的研究^[9-13]，但这些动物实验的PM_2.5染尘，多采用PM_2.5肺部滴注进行染尘，动物自然呼吸空气进行PM_2.5染毒实验少见报道。本研究利用全身暴露染毒系统，实时收集PM_2.5进行Wistar大鼠染毒实验，试图寻找PM_2.5引起肺癌的动物模型，为PM_2.5与肺癌关系研究提供动物实验基础。

经过9月的染毒实验，Wistar大鼠体质量与对照组相比，并无显著变化，行动和饮食并没有受到染毒影响。考虑可能是染毒时间太短或染毒的PM_2.5浓度低从而导致的对Wistar大鼠影响不显著。实验过程中观察到染毒至近8周时，Wistar大鼠出现异常呼吸音，此症状持续近3周左右，此后呼吸音逐渐正常，症状消失，观察PM_2.5质量浓度曲线图对应的时间显示，出现异常呼吸音的时间正好对应了此时段PM_2.5浓度较高，随后PM_2.5浓度逐渐降低，同时也出现了大鼠异常呼吸音逐渐消失的现象。此现象反映了PM_2.5质量浓度与致肺部病变有直接的关系。

历时9月的PM_2.5染毒实验，实验组Wistar大鼠肺组织中出现不同程度的结节，经病理学检测呈现广泛的肺实变，炎性增生，肺泡内充血，大量颗粒性物质在肺组织内沉着，支气管壁纤维化增厚。而对照组大鼠肺组织，肺泡完整，肺泡壁正常，未见纤维化、肺实变及肺泡内充血，未见异型增生细胞。HE染色结果显示实验组肺组织呈现了广泛炎性增生，并未出现不典型增生，出现此结果的原因考虑是由于染毒过程中PM_2.5采集是采用实时采集方式，PM_2.5的收集受到了外界环境空气质量影响很大，而且PM_2.5采集器随着采集时间的延长也会出现偶尔的堵塞现象导致了PM_2.5浓度受到一定影响，达不到一定的PM_2.5高浓度及浓度的稳定性。考虑到此原因，在以后的实验中会寻找一种能够稳定提供高浓度PM_2.5浓度的实验装置。形态学上没有找到肺癌组织形态，实验中进一步进行了与癌变有关因子的检测。

流式细胞术检测了大鼠T细胞免疫功能，结果显示，实验组与对照组相比，静脉血中CD3、CD4、CD8阳性细胞无显著性差异，但实验组CD4/CD8比值显著高于正常对照组。提示了实验组大鼠T细胞的免疫功能高于对照组，此结果与大鼠肺组织的炎性反应有关，也可能与肺早期癌变过程中刺激免疫系统从而引起的免疫功能增强。这需要在后期的实验中进一步验证。

CEA、CA125及SccAg是肿瘤早期诊断常用指标，实验中使用ELISA方法检测了大鼠静脉血及肺灌洗液中CEA、CA125及SccAg表达水平，显示实验组大鼠静脉血及肺灌洗液中CEA及SccAg高于对照组但无统计学意义，而实验组大鼠静脉血及肺灌洗液中CA125表达水平显著高于对照组。同时检测了肺组织细胞周期、凋亡及DNA含量，结果显示，实验组大鼠肺组织细胞增殖高于对照组，但无统计学意义，实验组大鼠肺组织细胞凋亡率显著低于对照组，而细胞DNA含量显著高于对照组，这些结果提示实验组肺组织有癌变的趋势，持续高浓度的染毒可能会导致肺组织早期癌变，但这种假设需要进一步的实验研究进行证实。

以上结果显示，长期接触PM_2.5会造成肺组织出现不同程度结节，呈现出广泛的炎性反应增生、肺实变及肺泡充血等变化，提示结节组织有向早期癌发生的趋势，但PM_2.5是否能引起肺癌变需要进一步的实验研究。