2017, Vol. 44
RNF8的亚细胞定位及其在胃癌中的表达与凋亡调控
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管，湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
文章信息
- RNF8的亚细胞定位及其在胃癌中的表达与凋亡调控
- Subcellular Localization of RNF8 and Its Expression and Role in Apoptosis of Gastric Cancer
- 肿瘤防治研究, 2017, 44(9): 575-579
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(9): 575-579
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2017.17.0091
- 收稿日期: 2017-02-03
- 修回日期: 2017-06-13
引用本文 |
刘健, 雷箴, 袁雯, 赵枚, 黄常志. RNF8的亚细胞定位及其在胃癌中的表达与凋亡调控[J]. 肿瘤防治研究, 2017, 44(9): 575-579.
LIU Jian, LEI Zhen, YUAN Wen, ZHAO Mei, HUANG Changzhi. Subcellular Localization of RNF8 and Its Expression and Role in Apoptosis of Gastric Cancer[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(9): 575-579.
RNF8的亚细胞定位及其在胃癌中的表达与凋亡调控
1. 100020 北京，首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心;
2. 100021 北京，国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院病因室，分子肿瘤学国家重点实验室，癌发生及预防分子机理北京市重点实验室
2. 100021 北京，国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院病因室，分子肿瘤学国家重点实验室，癌发生及预防分子机理北京市重点实验室
摘要:
目的
研究环指蛋白8（ring finger protein 8, RNF8）的亚细胞定位及其在胃癌中的表达及功能。方法
构建RNF8正常及突变的真核表达载体，转染HEK293细胞，激光共聚焦显微镜下观察其亚细胞定位情况；利用Western blot及RT-PCR法分别检测RNF8在胃癌组织及细胞中的表达情况；利用流式细胞仪检测RNF8高表达对胃癌细胞凋亡的影响。结果
野生型RNF8主要定位于胞核，其指环（RING）结构域和叉头相关（forkhead-associated domain, FHA）结构域突变均对RNF8的胞核定位有一定的影响；RNF8在胃癌细胞中的表达明显下调；外源导入RNF8可以导致胃癌MGC803细胞发生凋亡。结论
RNF8可能通过调控细胞凋亡参与肿瘤发生发展过程。
关键词:
RNF8
亚细胞定位
胃癌
凋亡
Subcellular Localization of RNF8 and Its Expression and Role in Apoptosis of Gastric Cancer
1. Medical Research Center, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Beijing 100020, China;
2. State Key Laboratory of Molecular Oncology, Beijing Key Laboratory for Carcinogenesis and Cancer Prevention, Department of Etiology and Carcinogenesis, National Cancer Center/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China
2. State Key Laboratory of Molecular Oncology, Beijing Key Laboratory for Carcinogenesis and Cancer Prevention, Department of Etiology and Carcinogenesis, National Cancer Center/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China
Corresponding author:
HUANG Changzhi, E-mail: huang8849@126.com.
Abstract:
Objective
To investigate the subcellular localization of ring finger protein 8 (RNF8) and explore its expression and function in gastric cancer cells.
Methods
The fusion eukaryotic vectors expressing wide-type or mutant EGFP-RNF8 were constructed and transfected into HEK293 cells. The subcellular localization of RNF8 was observed under laser scanning confocal microscope; Western blot and RT-PCR were used to detect RNF8 expression in gastric cancer tissues and cell lines; the role of RNF8 on gastric cancer cell apoptosis was detected using flow cytometry.
Results
Wild-type RNF8 was mainly located in the nucleus, while both RING and forkhead-associated(FHA) domain mutations could partly affect nuclear localization; RNF8 showed a lower expression pattern in gastric cancer cells and its forced expression in gastric cancer cell line MGC803 led to cell apoptosis.
Conclusion
RNF8 may regulate the development of gastric tumor through modulating cancer cell apoptosis.
Key words:
RNF8
Subcellular localization
Gastric cancer
Apoptosis
0 引言
2.2 RNF8亚细胞定位分析
2.3 RNF8在胃癌细胞系及组织中表达下调
2.4 免疫组织化学结果提示RNF8在胃癌组织中表达下调
2.5 RNF8在胃癌细胞系MGC803中高表达促进肿瘤细胞凋亡
3 讨论
泛素化是蛋白质翻译后修饰的一个重要形式，它是在E1泛素激活酶、E2泛素结合酶以及E3泛素连接酶的级联调控作用下将泛素分子共价结合到底物靶蛋白赖氨酸残基上的一种特异性修饰过程[1-2]。泛素化在蛋白质的定位、调控和降解中都起着十分重要的作用。同时，它也参与了DNA损伤修复、细胞周期、增殖、凋亡、自噬等几乎一切基础生理过程的调控[3]。
RNF8是一个E3泛素连接酶蛋白，它包含一个指环（RING）结构域和一个叉头相关（forkhead-associated domain, FHA）结构域，其中RING是E3泛素连接酶的一种典型的结构域，而FHA存在于很多调控蛋白中，是一个磷酸化多肽识别结构域[4]，这种特殊的结构使RNF8成为一个连接蛋白质磷酸化和泛素化两个过程的重要蛋白。
研究发现RNF8在早期DNA损伤应答过程中发挥重要功能[5-8]。RNF8敲降可以显著影响DNA双链断裂（DNA double-strand break, DSB）相关的泛素化过程，抑制53BP1和BRCA1在DSB的招募[9]，并且还可以导致G2/M检验点缺陷[10]。泛素化与肿瘤的发生发展过程密切相关，虽然已经证实RNF8参与了众多与肿瘤发生发展相关的生物学过程，然而RNF8与肿瘤的关系及其在肿瘤中的作用目前依然所知甚少，本文就RNF8在胃癌细胞和组织中的定位、表达及功能进行探讨。
1 材料与方法 1.1 胃癌细胞株与临床标本胃正常黏膜上皮细胞系GES-1、胃癌细胞系BCC823、HGC27、MKN45、MGC803、SGC7901及AGS细胞均为实验室保存，培养条件为DMEM+10%胎牛血清，5%CO2。9例胃癌及癌旁组织取自中国医学科学院肿瘤医院的胃癌患者。标本获得前，患者未接受手术、放疗和化疗，无其他部位肿瘤或严重系统性疾病，且均经过病理学检查确诊。所有参与者均对本研究知情同意，并通过伦理委员会批准。
1.2 主要试剂DMEM培养液、脂质体Lipofectamine2000和TRIzol购自美国Invitrogen公司，胎牛血清购自美国HyClone公司；反转录试剂盒、快速定点突变试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒和β-actin兔源多克隆抗体购自美国Sigma公司；RNF8兔源多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的二抗、含DAPI的封片剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PI DNA染色试剂购自美国BD公司。
1.3 突变型RNF8真核表达载体的构建pEGFPC1-RNF8真核表达质粒为实验室前期构建和保存，FHA及RING结构域突变型的真核表达载体RNF8 *FHA (R42A)和RNF8 *RING（C403S）利用天根公司快速定点突变试剂盒构建，并按说明书进行操作。通过测序对突变位置进行序列比对鉴定；然后将构建好的真核表达载体通过脂质体转染HEK293细胞，收取转染后的细胞进行Western blot鉴定以确定其可以顺利编码蛋白。
1.4 Western blot技术检测RNF8的表达情况收集转染后的细胞系或临床组织标本，用RIPA裂解液进行充分裂解，通过BCA试剂盒法测蛋白浓度，分别取80 μg蛋白上样进行琼脂糖凝胶（SDS-PAGE）电泳分离。半干法转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜；TBST洗3次后二抗室温孵育1 h。ECL化学发光法曝光显影。
1.5 RT-PCR法检测RNF8在胃癌及胃正常细胞系中的表达TRIzol法提取各组细胞总RNA，检测总RNA的完整性、浓度和纯度，根据反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA，进行PCR扩增。PCR引物序列如下：RNF8-Forward: 5’-TCCCATTTACCCTGGCTTCC-3’，RNF8-Reverse: 5’-GGGCATTCTATCTTCCGCTTC-3’；β-actin-Forward: 5’-GGGACCTGACTGACTACCTC-3’；β-actin-Reverse: 5’-TCATACTCCTGCTTGCTGAT-3’。取扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，利用Image J软件分析条带灰度值。目的基因mRNA相对表达水平=目的基因灰度值/β-actin灰度值。
1.6 野生型及突变型RNF8亚细胞定位研究提前24 h将HEK293细胞接种于6孔板中，制作细胞爬片；然后利用脂质体法分别将野生型及突变型RNF8真核表达载体转染至HEK293细胞中，6 h后换液，48 h后取出爬片，用含DAPI的封片剂封片后于共聚焦显微镜下观察。
1.7 流式细胞术检测细胞凋亡比例取对数生长期细胞接种于6孔板中，24 h待细胞完全贴壁后，用脂质体法将对照pEGFPC1及pEGFPC1-RNF8真核表达质粒转染至MGC803细胞中，48 h后消化收集细胞，PBS洗一遍，75%酒精固定过夜，PBS洗一遍，弃上清液，留100 μl左右悬浮细胞，加1 ml PI染色，上流式细胞仪，通过Sub-G1细胞的比例分析RNF8对胃癌细胞凋亡的影响。
1.8 免疫组织化学分析RNF8在胃正常及肿瘤组织中的表达情况数据来源于人类蛋白质图谱数据库（The Human Protein Atlas, http://www.proteinatlas.org）；染色用RNF8抗体：HPA050731，Sigma-Aldrich。
2 结果 2.1 RNF8及其突变体真核表达载体的构建及鉴定为了研究RNF8的定位，及其结构域突变对RNF8定位的影响，我们构建了RNF8野生型（pEGFPC1-RNF8）及FHA和RING结构域突变型的真核表达载体RNF8*FHA（R42A）和RNF8 *RING（C403S），见图 1A；测序结果显示突变体构建成功，见图 1B~1C；将构建好的真核表达载体及对照载体分别转染HEK293细胞，48 h后收集细胞，经Western blot技术鉴定证实野生型及突变型RNF8真核表达载体均可以成功表达，见图 1D。
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| A: structure diagram of wide-type and mutant RNF8; B: sequencing results indicated that the mutant pEGFPC1-RNF8 *FHA (R42A) was successfully constructed; C: sequencing results indicated that the mutant RNF8 *RING (C403S) was successfully constructed; D: Western blot results showed that the wide-type and mutant RNF8 were successfully expressed in cells 图 1 RNF8突变体构建及鉴定 Figure 1 Construction and identification of mutant ring finger protein 8 (RNF8) |
将构建好的pEGFP-RNF8及突变真核表达载体瞬时转染HEK293细胞，48 h后利用激光共聚焦显微镜观察RNF8及其突变体的亚细胞定位情况。结果表明野生型RNF8蛋白主要定位于胞核，见图 2A，而FHA及RING结构域的突变均可导致出现一定比例的胞质分布，表明FHA及RING结构域均在RNF8核定位中发挥作用，见图 2B~2C。
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| A: localization of wide-type RNF8 in cells; B: localization of FHA domain mutant RNF8 in cells; C: localization of RING domain mutant RNF8 in cells 图 2 RNF8及其突变体在细胞中的定位 Figure 2 Subcellular localization of wide-type and mutant RNF8 |
首先对RNF8在胃正常GES-1及胃癌细胞系BCC823、HGC27、MKN45、MGC803、SGC7901及AGS中的表达情况进行了RT-PCR检测。结果发现与正常胃细胞系GES-1相比，胃癌细胞系中RNF8的表达均有明显下调，在HGC27、MGC803及SGC7901中的下调最为明显。进一步利用Western blot技术检测了RNF8在胃癌及其配对癌旁组织中的表达情况，结果发现在9对配对组织中，有6对（66.7%）在癌旁组织中明显下调，3对没有明显改变或略微上调，表明RNF8在胃癌组织中具有下调趋势，见图 3。
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| 1: negative control; 2: BGC823; 3: HGC27; 4: MKN45; 5: MGC803; 6: GES-1; 7: SGC7901; 8: AGS; M: marker; A: RT-PCR detection of RNF8 expression in gastric normal GES-1 and cancerous BCC823, HGC27, MKN45, MGC803, SGC7901 and AGS cell lines; B: bar chart showed RNF8 expressions in different cell lines; C: two representative images showed the down-regulation of RNF8 expression in gastric cancer tissues detected by Western blot (C: cancer tissues; N: non-cancerous adjacent tissues) 图 3 RNF8在胃癌细胞系及组织中表达情况 Figure 3 Expression of RNF8 in gastric cancer cell lines and tissues |
为了进一步验证RNF8在胃癌中的表达情况，我们对人类蛋白质图谱数据库（http://www.proteinatlas.org/）中RNF8在胃癌及胃正常组织中的免疫组织化学蛋白表达情况进行了查询和分析。结果表明，RNF8在5个胃癌正常样本中均呈现高表达（100%），而在12个胃癌组织样本中，只有1个高表达（8.3%），4个中表达（33.3%），2个低表达（16.7%），5个未检出表达（41.7%）。同样表明RNF8在胃癌中的表达显著低于正常组织，见图 4。
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| A: the high expression of RNF8 in normal gastric tissues; B: gastric cancer tissues with undetectable or low RNF8 expression 图 4 人蛋白质图谱数据库中免疫组织化学分析RNF8在胃正常及胃癌组织中的表达情况 Figure 4 Immunohistochemistry staining of RNF8 expression in normal and cancerous gastric tissues from human protein atlas |
为了验证RNF8在胃癌细胞中的功能，我们将pEGFP-RNF8及其对照载体瞬时转染MGC803胃癌细胞系，48 h后收细胞，PI染色后利用流式细胞仪技术检测RNF8对胃癌细胞系凋亡的影响。结果表明与亲本组及空载对照组相比（0.52±0.21）% vs.（2.53±1.02）%，RNF8的瞬时高表达组（23.9±3.17）%凋亡比例明显升高（P < 0.01），表明RNF8具有促进胃癌细胞凋亡的功能，见图 5。
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| A: the expression of wide-type RNF8 and control vectors in MGC803 cells detected by RT-PCR; B: the effect of RNF8 overexpression on cell apoptosis detected by flow cytometry. Sub-G1 represented the death cells 图 5 RNF8在胃癌细胞系MGC803中过表达导致明显的细胞凋亡 Figure 5 Overexpression of RNF8 in gastric cancer MGC803 cells led to apparent apoptosis |
人类基因组中有33个基因编码蛋白含有FHA结构域（Pfam ID PF00498），258个基因含有RING结构域（Pfam ID PF00097），然而只有CHFR（checkpoint with forkhead and ring finger domains）和RNF8两个蛋白同时含有这两个结构域[11]，提示这两个蛋白可能具有类似的功能机制。大量证据表明E3泛素连接酶CHFR在肿瘤中发挥抑癌蛋白的作用，其在肿瘤中往往由于启动子CpG的甲基化而表达受到抑制[12-13]。然而RNF8与肿瘤的关系及其在肿瘤中的作用目前依然少有研究。
蛋白的功能机制与其亚细胞定位有着非常密切的关系，通过对野生型及突变型的亚细胞定位分析发现，RNF8在细胞核中主要定位于胞核，RING和FHA中的任何一个结构域发生突变均会对其胞核定位产生一定的影响。
为了研究RNF8与胃癌的关系，我们分别利用RT-PCR及Western blot检测了RNF8在胃癌及胃正常细胞系、胃癌组织及其配对癌旁组织中的表达情况，结果表明RNF8在胃癌细胞系中的表达低于胃正常细胞系，在胃癌组织中的表达要低于其癌旁组织，提示RNF8在胃癌中有下调趋势。而流式细胞技术结果显示上调RNF8表达后可以显著提高胃癌细胞系MGC803细胞的凋亡比例，提示RNF8在胃癌细胞的凋亡调控中发挥一定的功能。以上证据提示RNF8在胃癌的发生发展过程中可能同样发挥抑癌蛋白的作用。目前已有研究表明RNF8在DNA双链断裂的损伤修复过程中发挥重要功能，因此我们推测RNF8的下调有可能会通过影响细胞的DSB修复过程，导致基因组异常修复或错配积累，最终促进肿瘤的发生。RNF8在胃癌中的促凋亡功能是否与其DSB损伤修复功能有关还需要进一步的实验验证。
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