2017, Vol. 44
Atg3及自噬对非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管，湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
文章信息
- Atg3及自噬对非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响
- Effect of Atg3 and Autophagy on Migration of Non-small Cell Lung Cancer A549 Cells
- 肿瘤防治研究, 2017, 44(8): 525-529
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(8): 525-529
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2017.16.1017
- 收稿日期: 2016-08-22
- 修回日期: 2017-03-12
引用本文 |
周小果, 韩玉辉, 党强, 郭娜. Atg3及自噬对非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响[J]. 肿瘤防治研究, 2017, 44(8): 525-529.
ZHOU Xiaoguo, HAN Yuhui, DANG Qiang, GUO Na. Effect of Atg3 and Autophagy on Migration of Non-small Cell Lung Cancer A549 Cells[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(8): 525-529.
Atg3及自噬对非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响
473000 南阳，南阳市中心医院呼吸内科
摘要:
目的
探讨自噬相关基因Atg3和自噬对非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响及相关机制。方法
饥饿处理诱导非小细胞肺癌A549细胞自噬，Transwell法检测细胞迁移能力的变化，Western blot检测自噬相关基因Atg3的表达。转染Atg3 siRNA靶向沉默Atg3的表达，Transwell法检测细胞迁移能力的变化、流式细胞术检测细胞凋亡、Western blot检测细胞的自噬活性以及E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、vimentin、Notch和snail的表达。结果
饥饿处理可诱导非小细胞肺癌A549细胞自噬活性增强，并提高Atg3的表达，促进细胞迁移，而不影响细胞凋亡。沉默Atg3可抑制饥饿诱导的细胞自噬及迁移，而不影响细胞凋亡。此外沉默Atg3之后，E-cadherin和β-catenin的表达明显升高，而N-cadherin、vimentin、Notch和snail的表达明显降低。结论
沉默Atg3可减弱自噬活性，抑制A549细胞的迁移；其机制可能与Notch/snail信号通路活性降低进而影响细胞的EMT进程有关。
关键词:
Atg3
自噬
EMT
非小细胞肺癌
Effect of Atg3 and Autophagy on Migration of Non-small Cell Lung Cancer A549 Cells
Department of Respiratory Medicine, Nanyang Centre Hospital, Nanyang 473009, China
Abstract:
Objective
To investigate the effect of Atg3 and autophagy on the migration of non-small cell lung cancer cell line A549 and its possible mechanisms.
Methods
Starvation-induced autophagy was used in non-small cell lung cancer cell lines A549. Cell migration was calculated by Transwell assay and the expression of Atg3 was measured with Western blot. The Atg3 expression with Atg3 siRNA was down-regulated, and then cell migration was calculated by CCK-8 assay. Meanwhile, cell apoptosis was measured by flow cytometry, the autophagic activity and the expression of E-cadherin, β-catenin, N-cadherin, vimentin, Notch and snail were detected by Western blot.
Results
Autophagic activities were effectively induced by starvation, with a stronger cell migration ability and higher Atg3 expression, while with no affection on cell apoptosis. The whole process of starvation-induced cell autophagy and migration could be suppressed by Atg3 knockdown; but Atg3 knockdown didn't affect cell apoptosis. Other than that, the knockdown of Atg3 was accompanied with higher E-cadherin and β-catenin expression, and lower expression of N-cadherin, vimentin, Notch and snail.
Conclusion
The down-regulation of Atg3 could suppress cell autophagy and migration in non-small cell lung cancer. And its mechanism may be related to suppressing EMT progress via Notch/snail pathway.
Key words:
Atg3
Autophagy
EMT
Non-small cell lung cancer
0 引言
2.2 自噬对细胞迁移的影响
2.3 沉默Atg3对细胞自噬的影响
2.4 沉默Atg3对自噬诱导的细胞迁移的影响
2.5 细胞的EMT进程及相关信号通路的活性
3 讨论
肺癌是目前威胁人类生命健康的主要恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居于第一位[1]。而非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌中最主要的类型，转移是其恶性特征，也是影响患者生存率及预后的重要原因[2-3]。因此，探讨非小细胞肺癌扩散转移的相关机制对于延长患者生存时间，改善预后具有重要的临床意义。
自噬（autophagy）是细胞内异于细胞凋亡的一种“自我消化”过程，参与调节机体的众多生理病理过程[4]。然而自噬在肿瘤发生发展中的作用仍有很大的争议。Liang等[5]研究显示，在卵巢癌多药耐药细胞SKVCR中自噬活性明显高于亲本细胞SKOV3，且预孵3-MA和CQ可促进SKVCR细胞凋亡，部分逆转其耐药。Fu等[6]研究则表明，通过激活Beclin-1活化自噬可抑制肿瘤的发生。White[7]发现永生化的乳腺上皮细胞在Beclin-1缺失的小鼠体内具有更强的成瘤性。关于自噬在非小细胞肺癌中的作用并没有确切的研究。自噬体的形成又受到自噬相关基因的调控，其中Atg3（Autophagy related gene 3）及其对应的蛋白是一种泛素样缀合酶，在LC3蛋白的脂化系统中起到重要的调节作用[8-10]。本实验通过饥饿诱导建立自噬模型，并干扰Atg3的表达来探究自噬相关基因Atg3和自噬对非小细胞肺癌迁移的影响及相关机制。
1 材料与方法 1.1 材料胎牛血清（FBS），DMEM培养液及Opti-NEM培养液均购自美国Gibco公司；实验用人非小细胞肺癌细胞株A549购自中国科学院上海细胞库；Atg3、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、vimentin、Notch、snail及GAPDH抗体购自英国Abcam公司；LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司；针对Atg3的siRNA干扰链、干扰试剂及SYBR GreenⅠreal-time PCR kit由上海吉玛制药技术有限公司提供；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养、转染和分组实验用A549细胞株常规培养于含10%FBS的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养，每2天换液，3~5天消化传代。取对数期细胞常规消化后接种至6孔板中，待细胞融合至60%~80%，换无血清的培养液同步化12 h，随后依照说明书操作步骤进行转染。组别设为空白对照组（Ctrl）；阴性对照组（negative control siRNA, Neg）；干扰组（Atg3 siRNA, siRNA）。转染方法：将小分子干扰链和Lipofectamine2000分别用Opti-MEM培养液稀释并孵育5 min，将两者轻柔混合，室温静置20 min。将混合物按组别加入各组细胞中，于细胞培养箱中孵育6 h后更换为正常DMEM培养液继续培养48 h。测定干扰效率并进行后续实验分析。
1.2.2 AnnexinⅤ/PI双染色法检测细胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化各组细胞后，离心收集细胞，PBS漂洗5 min×3次；加Binding Buffer重悬细胞，然后避光加AnnexinⅤ-FITC室温反应10 min。最后避光加PI反应5 min。流式细胞仪检测荧光强度，检测条件：激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm。
1.2.3 Transwell细胞迁移分析常规消化、离心，收集各组细胞，加培养液重悬细胞，调整各组细胞密度为2×105个每毫升。将细胞接种于Transwell小室的上室中，并在下室内加入完全培养液，置于细胞培养箱中继续培养6 h。取出后，PBS冲洗5 min×3次，并擦除上室表面的细胞。90%乙醇固定细胞，0.1%结晶紫染色，PBS再次漂洗后置于倒置显微镜下观察并计数染色细胞的个数（每组细胞计数3个视野取均值）。
1.2.4 实时定量PCR检测mRNA的表达细胞总RNA的抽提参考TRIzol一步法的操作说明进行。纯化后测定浓度并取2 μg总RNA在反转录酶的作用下反转录至终体积为20 μl，SYBR GreenⅠreal-time PCR法检测mRNA的相对表达。引物设计如下：Atg3上游引物：5′-GGAAGAAGATGAAGATGAA-3′；下游引物5′-CATAATCGTGGAGTCTGGTA-3′。GAPDH作为内参，上游引物：5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′；下游引物：5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′。PCR反应体系：1 μl反转录产物，10 μl SYBR Green PCR Master Mix和100 nmol/L引物，调整总体积为25 μl。PCR反应条件：95℃预变性5 min，然后进行40个循环（92℃ 10 s, 60℃ 50 s）。扩增完成后，记录Ct值，2-ΔΔCT法分析Atg3 mRNA相对表达量。
1.2.5 Western blot测定蛋白表达水平常规提取各组细胞蛋白，采用BCA试剂盒对蛋白进行定量。调整上样蛋白至80 μg，加入4倍体积的蛋白上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳。分离后将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭90 min，按说明书要求加入相应比例的一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤5 min×3次；复温后加入相应的二抗室温下孵育120 min，TBST洗涤10 min×3次。暗室中显影、定影并冲洗胶片。所得结果用Image J行灰度分析。
1.3 统计学方法所得数据均录入SPSS13.0统计软件中进行分析。实验结果计量资料用均数±标准差（x±s）表示。两组计量资料的组间差异采用t检验，多组计量资料行单因素方差分析，多组计量资料的两两比较采用Bonferroni校正的t检验，计数资料的比较采用χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 饥饿诱导细胞自噬模型的建立本实验采用无血清的培养液孵育A549细胞作饥饿处理，并检测细胞的自噬活性，结果见图 1。饥饿处理12 h时，细胞中Atg3的蛋白表达水平显著增加（P=0.008），且LC3Ⅱ/Ⅰ的比值显著增加。结果提示，饥饿处理可诱导A549细胞发生自噬并伴随Atg3的高表达。
|
| *: P < 0.05, compared with 0 h; n=6 图 1 饥饿促进A549细胞LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg3的表达 Figure 1 Starvation increased LC3Ⅱ/Ⅰ and Atg3 expression in A549 cells |
饥饿处理12 h后细胞迁移率相对于对照组为（138.27±4.36）%（P=0.019），说明在A549细胞中自噬的出现可明显促进细胞迁移，见图 2A。此外，流式细胞术检测细胞凋亡显示，饥饿处理对细胞的凋亡并不会产生明显的影响，见图 2B。这一结果提示，饥饿处理导致的细胞迁移能力增强是由自噬所致，与细胞的凋亡无明显关系。
|
| A: autophagy promoted cell migration; B: autophagy had no effect on cell apoptosis; *: P < 0.05, compared with Control group(Ctrl); n=6 图 2 自噬对细胞迁移及凋亡的影响 Figure 2 Effect of autophagy on migration and apoptosis of A549 cells |
转染Atg3 siRNA沉默细胞中Atg3的表达后，相比于对照组，siRNA组细胞中Atg3的mRNA及蛋白表达水平显著降低（P=0.016），且LC3Ⅱ/Ⅰ的比值显著降低。A549细胞的自噬活性显著降低（P=0.012），见图 3。
|
| A-B: the efficiency of Atg3 knockdown; C: Atg3 knockdown suppressed the autophagy; *: P < 0.05, compared with Ctrl; n=6 图 3 沉默Atg3对A549细胞自噬的影响 Figure 3 Effect of Atg3 knockdown on autophagy of A549 cells |
Transwell细胞迁移实验检测结果显示，沉默Atg3后细胞迁移率相对于对照组为（62.14±2.27）%（P=0.026），见图 4A。说明在A549细胞中沉默Atg3可明显抑制细胞迁移。此外，流式细胞术检测细胞凋亡显示，沉默Atg3对细胞的凋亡并不会产生明显的影响，见图 4B。
|
| A: Atg3 knockdown suppressed cell migration; B: Atg3 knockdown had no effect on cell apoptosis; *: P < 0.05, compared with Ctrl; n=6 图 4 沉默Atg3对细胞迁移及凋亡的影响 Figure 4 Effect of Atg3 knockdown on migration and apoptosis of A549 cells |
沉默Atg3后E-cadherin和β-catenin的表达明显升高，而N-cadherin、vimentin、Notch和snail的表达明显降低（P=0.018）。结果提示沉默Atg3所致的细胞迁移抑制作用可能与Notch/snail信号通路活性降低影响EMT进程有关，见图 5。
|
| A-B: Atg3 knockdown suppressed cell EMT progress; C: Atg3 knockdown suppressed the activation of Notch/snail pathway; *: P < 0.05, compared with Ctrl; n=6 图 5 沉默Atg3对A549细胞EMT进程和Notch/snail活性的影响 Figure 5 Effect of Atg3 knockdown on EMT progress and activation of Notch/snail pathway in A549 cells |
近年来大量的研究表明自噬可参与调节肿瘤的形成、转移、能量代谢及微环境稳定等，通过改变自噬活性来抑制肿瘤的发生发展已成为肿瘤治疗的一个新方向。
自噬相关基因Atg3是调节自噬体形成的一个重要基因。目前关于Atg3在肿瘤中的作用研究甚少，Yang等[11]发现在HCC中HOTAIR可通过上调Atg3和Atg7的表达增强细胞自噬活性，促进细胞增殖。Jeyamohan等[12]在研究欧甘菊对HeLa细胞凋亡和自噬的作用时表示，欧甘菊可激活自噬，促进凋亡的作用机制中包括Atg3表达的上调。而Lee等[13]在研究埃罗替尼耐药肺癌细胞株ERPC9时，检测到Atg3的高表达，且沉默Atg3之后可通过诱导耐药细胞发生自噬，促进细胞死亡，来增加细胞对化疗药物的敏感度。研究表明自噬对肿瘤细胞的生长具有抑制和促进的双重作用，具体的作用表现取决于肿瘤的类型[14-15]。目前，在A549细胞中Atg3的具体作用及相关机制并没有明确的研究。本研究在饥饿诱导A549细胞自噬模型中检测到Atg3高表达，提示Atg3在饥饿模型所致A549细胞生物学行为改变中可能具有一定的作用。为进一步探究其与非小细胞肺癌之间的关系，本研究通过转染Atg3 siRNA干扰A549细胞中Atg3的表达，并检测自噬活性及细胞迁移能力的改变。结果显示，A549细胞中沉默Atg3可抑制饥饿诱导的细胞自噬，同时抑制细胞迁移，但不影响细胞凋亡。
EMT在肺癌的侵袭迁移中发挥着重要的作用，并与其抗肿瘤治疗密切相关[16-17]。本研究进一步研究了沉默Atg3抑制细胞迁移的相关作用机制。结果发现，沉默Atg3后上皮细胞标志物（E-cadherin, β-catenin）表达升高而间质细胞标志物（N-cadherin, vimentin）的表达明显下降。说明沉默Atg3可抑制A549细胞的EMT进程。Notch信号通路是一条多调控的复杂通路，在肿瘤相关的EMT过程中同样发挥重要的作用[18-19]。本研究检测了Atg3对Notch信号通路的影响，结果发现，沉默Atg3可抑制Notch和snail的表达说明对EMT的影响可能与Notch/snail信号通路有关，但是是否还有其他通路的参与及其具体的调控机制还有待进一步研究。
综上所述，本研究表明沉默Atg3可减弱自噬活性，抑制非小细胞肺癌的迁移；其机制可能与Notch/snail信号通路活性降低进而影响细胞的EMT进程有关。
参考文献
| [1] | Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(1): 5–29. DOI:10.3322/caac.21254 |
| [2] | Dela Cruz CS, Tanoue LT, Matthay RA. Lung cancer: epidemiology, etiology, and prevention[J]. Clin Chest Med, 2011, 32(4): 605–44. DOI:10.1016/j.ccm.2011.09.001 |
| [3] | Califano R, Kerr K, Morgan RD, et al. Immune Checkpoint Blockade: A New Era for Non-Small Cell Lung Cancer[J]. Curr Oncol Rep, 2016, 18(9): 59. DOI:10.1007/s11912-016-0544-7 |
| [4] | Hsu P, Shi Y. Regulation of autophagy by mitochondrial phospholipids in health and diseases[J]. Biochim Biophys Acta, 2017, 1862(1): 114–29. DOI:10.1016/j.bbalip.2016.08.003 |
| [5] | Liang B, Liu X, Liu Y, et al. Inhibition of autophagy sensitizes MDR-phenotype ovarian cancer SKVCR cells to chemotherapy[J]. Biomed Pharmacother, 2016, 82: 98–105. DOI:10.1016/j.biopha.2016.04.054 |
| [6] | Fu LL, Cheng Y, Liu B. Beclin-1: autophagic regulator and therapeutic target in cancer[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013, 45(5): 921–4. DOI:10.1016/j.biocel.2013.02.007 |
| [7] | White E. The role for autophagy in cancer[J]. J Clin Invest, 2015, 125(1): 42–6. DOI:10.1172/JCI73941 |
| [8] | Murrow L, Debnath J. ATG12-ATG3 connects basal autophagy and late endosome function[J]. Autophagy, 2015, 11(6): 961–2. DOI:10.1080/15548627.2015.1040976 |
| [9] | Metlagel Z, Otomo C, Ohashi K, et al. Structural insights into E2-E3 interaction for LC3 lipidation[J]. Autophagy, 2014, 10(3): 522–3. DOI:10.4161/auto.27594 |
| [10] | Li W, Yang Y, Hou X, et al. MicroRNA-495 regulates starvation-induced autophagy by targeting ATG3[J]. FEBS Lett, 2016, 590(6): 726–38. DOI:10.1002/1873-3468.12108 |
| [11] | Yang L, Zhang X, Li H, et al. The long noncoding RNA HOTAIR activates autophagy by upregulating ATG3 and ATG7 in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Biosyst, 2016, 12(8): 2605–12. DOI:10.1039/C6MB00114A |
| [12] | Jeyamohan S, Moorthy RK, Kannan MK, et al. Parthenolide induces apoptosis and autophagy through the suppression of PI3K/Akt signaling pathway in cervical cancer[J]. Biotechnol Lett, 2016, 38(8): 1251–60. DOI:10.1007/s10529-016-2102-7 |
| [13] | Lee JG, Wu R. Combination erlotinib-cisplatin and Atg3-mediated autophagy in erlotinib resistant lung cancer[J]. PLoS One, 2012, 7(10): e48532. DOI:10.1371/journal.pone.0048532 |
| [14] | Kaser A, Blumberg RS. Autophagy, microbial sensing, endoplasmic reticulum stress, and epithelial function in inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology, 2011, 140(6): 1738–47. DOI:10.1053/j.gastro.2011.02.048 |
| [15] | Li Y, Zhang J, Chen X, et al. Molecular machinery of autophagy and its implication in cancer[J]. Am J Med Sci, 2012, 343(2): 155–61. DOI:10.1097/MAJ.0b013e31821f978d |
| [16] | Li Y, Chen P, Zu L, et al. MicroRNA-338-3p suppresses metastasis of lung cancer cells by targeting the EMT regulator Sox4[J]. Am J Cancer Res, 2016, 6(2): 127–40. |
| [17] | Mittal V. Epithelial Mesenchymal Transition in Aggressive Lung Cancers[J]. Adv Exp Med Biol, 2016, 890: 37–56. DOI:10.1007/978-3-319-24932-2 |
| [18] | Gao XJ, Liu JW, Zhang QG, et al. Nobiletin inhibited hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition of lung cancer cells by inactivating of Notch-1 signaling and switching on miR-200b[J]. Pharmazie, 2015, 70(4): 256–62. |
| [19] | Hassan WA, Yoshida R, Kudoh S, et al. Notch1 controls cell invasion and metastasis in small cell lung carcinoma cell lines[J]. Lung Cancer, 2014, 86(3): 304–10. DOI:10.1016/j.lungcan.2014.10.007 |