0 引言

在我国，癌症的发生率和死亡率逐日上升，已经成为导致人类死亡的主要原因^[1]。肿瘤的发生、发展备受关注，但其机制尤为复杂。胶原重构以及细胞外基质硬化能促进肿瘤的发生和发展^[2-3]。近几年的研究表明Ⅰ型胶原修饰的关键酶与肿瘤的发生发展密切相关，如脯氨酰羟化酶（prolyl-4- hydroxylase, P4H）, 赖氨酰羟化酶（lysyl Hydroxylase, LH）以及赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase, LOX）。这些酶在胶原翻译后的修饰如氨基酸残基的羟基化、交联的形成以及维持胶原的稳定结构中起着重要的作用。胶原是细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的重要组成部分, 并与肿瘤微环境的改变密切相关。机体正常的情况下，胶原呈网状地围绕在细胞周围，对细胞的生长和迁移有一定的限制作用。当细胞发生癌变后，胶原结构改变，呈条索状线性分布在肿瘤细胞周围。这种改变有利于肿瘤细胞沿着胶原的线性结构迁移，从而肿瘤细胞的侵袭能力增强，突破基底膜发生转移。同时，胶原失去对细胞生长的限制作用，从而肿瘤细胞增殖能力也增强。在肿瘤细胞中，上述三种胶原修饰关键酶参与胶原交联构型改变、胶原重构以及细胞外基质硬化等而促进肿瘤的发生和发展。

1 胶原修饰酶简介 1.1 脯氨酰羟化酶

胶原的生物合成包含一系列复杂的过程，包括转录、翻译和翻译后的修饰以及分泌等。脯氨酰羟化酶（P4H）是由2个α亚基和2个β亚基构成的α2β2四聚体，其中α亚基（P4Hα）具有三种亚型，分别由P4HA1、P4HA2、P4HA3基因编码，而β亚基（P4Hβ）仅有一种亚型，由P4HB基因编码^[4]。其中，PAHA1表达于大多数细胞；P4HA2在软骨细胞、成骨细胞以及毛细管内皮细胞中均有表达；P4HA3在成年组织以及胚胎组织中均能被检测到，但其表达量非常低。在细胞内，脯氨酰羟化酶（P4H）参与胶原的修饰，催化前胶原多肽链脯氨酸残基的羟基化，使前胶原分子在胞内形成稳定的三螺旋结构。在细胞外基质中，P4HA1和P4HA2参与胶原沉积^[5]。脯氨酰羟化酶（P4H）对胶原的稳定性起着重要的作用，当P4H活性降低或者表达下调时，胶原翻译后修饰形成的三螺旋发生降解，不能形成稳定的结构。相反则促进胶原沉积、硬度增加。

1.2 赖氨酰羟化酶

作为一种功能性的酶，赖氨酸羟化酶（LH）在胶原修饰中催化前胶原螺旋区以及端肽的赖氨酸羟基化，共三种亚型，分别由Plod1、Plod2以及Plod3编码，其中LH2（PLOD2）又有两种亚型，即LH2a和LH2b。LHb广泛表达，是LH2的主要亚型。PLOD1特异性修饰螺旋内部或中心片段的赖氨酸，PLOD2特异性羟基化前胶原端肽的赖氨酸，而PLOD3修饰Ⅳ型、Ⅴ型胶原^[6]。端肽的赖氨酸的羟基化与胶原共价交联及组织硬度密切相关，因此，PLOD2是主要影响胶原共价交联的羟化酶。分泌出细胞外后，经PLOD2修饰的胶原蛋白端肽赖氨酸残基可相互交联形成稳定结构的羟赖氨酸吡啶链，相反，未发生羟基化的胶原蛋白所形成的纤维交联不稳定，容易降解^[7]。

1.3 赖氨酰氧化酶

胶原经P4HAs和LHs修饰以后，分泌到细胞外基质中并自我组装形成微纤维结构。形成微纤维结构过程中，胶原N端和C端的特异性赖氨酸残基和羟基化赖氨酸残基被赖氨酰氧化酶 ( LOX）氧化形成各自的醛化形式，随后，发生一系列缩合反应形成分子间和分子内的共价交联。这种交联结构使组织胶原纤维之间紧密连接, 增加了细胞外基质的稳定性, 并且可以抵抗胶原酶的水解^[8]。因此LOX的表达及其活性调节在保持ECM结构的完整性方面起重要作用。 同时它还具有许多重要的生物功能，包括细胞的分化、运动、迁移以及基因调控等^[9]。

2 胶原修饰酶与肿瘤发生发展 2.1 脯氨酰羟化酶与肿瘤发生发展

近年来，有文献报道P4HA2在许多实体瘤中表达上升，如口腔鳞癌^[10]、胃癌^[11]、乳腺癌等^[12]。Chen等^[13]通过研究62例未接受过药物治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）临床样本，探索非小细胞肺癌中脯氨酰羟化酶与细胞凋亡之间的关系，q-PCR结果显示，与癌旁正常组织相比，肺癌组织中脯氨酰羟化酶P4HA1~3型mRNA的表达量显著升高，上调的样本比例分别为85.5%、77.4%、95.2%。Chakravarthi等^[14]研究发现P4HA1在转移的前列腺癌细胞中过表达，83例前列腺癌临床样本显示转移性前列腺癌（n=13）中P4HA1的表达量远高于良性前列腺癌（P=0.001）；但是，在恶性前列腺癌组织中P4HA2的表达量远低于P4HA1，且在转移的肿瘤组织以及细胞系中，P4HA2的表达量与正常的组织以及细胞系无显著差异。另外，通过敲除前列腺癌细胞DU145和PC3的P4HA1编码基因后，细胞的增殖明显减少、迁移能力和浸润潜能下降，这表明P4HA1对前列腺癌细胞的转移和增殖至关重要。该研究在探索P4HA1的下游信号通路时，发现抑制基质金属酶-1（matrix Metalloprotease-1, MMP-1）能显著减弱高表达P4HA1的前列腺癌细胞侵袭能力，这提示P4HA1可能通过其下游的MMP-1发挥促肿瘤作用。同时该研究还证明了MiR-124（MicroRNA）能抑制P4HA1的表达，而其在前列腺癌细胞中下调使得P4HA1高表达。乳腺癌患者体内P4HA1和P4HA2 mRNA水平上升预示着不良的预后^[15]。Gilkes等^[16]对159例乳腺癌样本进行K-M生存曲线分析，发现患者体内P4HA水平越高，存活率越低。同时，体内实验证明给予脯氨酰羟化酶抑制剂DHB（3, 4-二乙基龙胆酸） 后，肿瘤中胶原含量（P<0.01）以及转移灶数目均显著下降（P<0.01）。同时，实验结果显示在缺氧条件下，缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α )、P4HA1、P4HA2均表达上调；抑制HIF-1α能显著下调P4HAs，并且敲除HIF-1α对肿瘤生长的抑制作用可被PAHAs高表达所逆转，这表明HIF-1α与P4HAs有着密切的关系。在进一步探索P4HAs促进乳腺癌转移相关机制的过程中，Xiong等^[17]发现乳腺癌组织中P4HA2与ColⅠA1、ColⅢA1以及ColⅣA1的表达密切相关（P<0.001），敲除PAHA2后ColⅠ、Col Ⅳ在乳腺癌细胞中的表达明显被抑制，这表明P4HA2的敲除使胶原的合成受抑制，从而减弱胶原的硬化起到抑制肿瘤发展的作用。同时，临床样本检测结果显示浸润性乳腺癌（P<0.001）、浸润性导管癌（P<0.001）、以及浸润性小叶癌（P<0.001）中P4HA2的表达量显著高于正常乳腺癌组织，临床样本结果表明ER阳性（n=1453）和ER阴性（n=473）乳腺癌中P4HA2的表达量与激素受体无关，但EGFR（表皮生长因子受体）阳性乳腺癌中P4HA2表达量明显高于EGFR阴性乳腺癌（P<0.01）。体内外实验表明P4HA2抑制剂（1, 4-DPCA）可以使3D培养的乳腺癌细胞增殖和浸润性表型明显受限，肿瘤中Ⅰ型胶原以及Ⅳ型胶原的沉积均减少，这也证明了P4HA2的促乳腺癌作用与胶原沉积相关。另外，还有研究结果显示敲除乳腺癌模型小鼠的P4HA2后，乳腺癌的增殖和转移受限制与激活转化生长因子β（TGF-β）相关^[18-19]。

2.2 赖氨酰羟化酶与肿瘤发生发展

赖氨酰羟化酶能增强胶原硬度、抑制胶原的降解，目前研究较多的是PLOD2及其亚型LH2b，且多数报道认为其与纤维化疾病的关系密切。近几年来，PLOD2在肿瘤发生发展中的作用研究受到重视。Nicastri等^[20]利用纳升级液相色谱串联质谱（Nano LC-MS/MS）技术，分析了19例结肠癌临床样本中表达明显上调的糖蛋白，PLOD2为其中一种。而在此之前尚无PLOD2与结直肠癌的相关报道，这使得PLOD2可能作为结直肠癌的一种生物标志物，为结肠癌的临床诊断提供新的指标。Noda等^[21]对139例肝癌患者标本进行反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）以及免疫组织化学分析，发现PLOD2的表达与肿瘤大小（P=0.022）以及肝内转移（P=0.049）呈正相关，PLOD2高表达的患者生存率显著低于低表达患者（P=0.002），因此PLOD2高表达可以独立作为肝癌不良预后因素。骨转移是实体瘤最常见的转移方式，Blanco等^[22]通过对比9种不同细胞株的骨转移能力，应用定量及非定量质谱分析法发现了包括PLOD2在内的若干种蛋白作为骨转移的预测因子。Eisinger-Mathason等^[23]研究发现荷瘤裸鼠注射米诺地尔（可以抑制PLOD2的表达^[24]）后，肿瘤组织Masson三色染色结果显示胶原沉积减少；在宫颈癌中，PLOD2的促转移作用可以被米诺地尔所抑制^[25]，这些研究表明PLOD2在肿瘤转移以及胶原重构中扮演着重要的角色。PLOD2基因是缺氧诱导基因，在其启动子区域含有HIF-1α的结合位点。但是Chen^[26]等发现尽管在4株肺腺癌细胞中PLOD2的表达水平有差异，而其HIF-1α的水平无显著差异，这说明HIF-1α水平上升不足以解释PLOD2的表达升高。于是笔者预测了PLOD2其他的启动子结合区域，发现信号转导与转录激活因子（signal transducer and activator of transcription, STAT3）也位于PLOD2的启动子区域，并在体外证明了STAT3通过与HIF-1α形成复合体，共同促进PLOD2在肿瘤细胞中的高表达，同时肿瘤相关成纤维母细胞（cancer associated fibroblasts, CAF）的旁分泌对肿瘤细胞中PLOD2的表达也有着促进作用。此外，该研究利用12例肺癌临床样本以及在细胞水平验证PLOD2高表达可以使胶原产生难以降解的吡啶链交联构型，从而肿瘤组织中胶原排列呈条索状的纤维束、硬度增加，并使其浸润和转移的能力增强^[26]。许多研究表明，PLOD2高表达往往意味着低的患者生存率。Gilkes等^[27]对159例临床样本进行K-M生存分析，发现PLOD2的表达量越高，患者的生存率越低（P<0.05）；同时，乳腺癌组织中PLOD1和PLOD2的水平明显高于正常组织（P<0.05, P<0.0001）和癌旁组织（P<0.05, P<0.0005）；体外实验中，沉默PLOD2的乳腺癌细胞注射至裸鼠后，乳腺癌淋巴结转移灶（P<0.001）和肺转移灶数量（P<0.001）明显下降，但其生长未受影响。此外，该研究还发现PLOD2敲除并没有改变肿瘤组织的胶原沉积，而是影响胶原纤维的形成。

2.3 赖氨酰氧化酶与肿瘤发生发展

近年有研究表明，赖氨酰氧化酶的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关，尤其是在促进肿瘤转移的过程中起着不可忽视的作用^[28-29]。Ping等^[30]对40例非小细胞肺癌临床样本进行q-PCR分析，发现非小细胞肺癌组织中LOX mRNA表达量远高于正常组织（P<0.01）；HIF-1α以及LOX与肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期有着显著相关性（P<0.01），两者可能协同促进非小细胞肺癌进展。LOX也可以通过促进上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition, EMT）而增强缺氧诱导的肿瘤浸润和侵袭^[31]。LOX促乳腺癌转移的机制较复杂，相关研究也很多。Zhu等^[32]证明LOX可以通过激活p38-MAPK通路调节血管生成因子（VEGF）的表达而促进肝癌细胞的生长以及转移。同时，LOX还可以作为肝癌的一个不良预后因素。通过siRNA干扰MDA-MB-231细胞中LOX的表达，Liu等^[33]发现MMP-2以及MMP-9表达量下降，乳腺癌细胞侵袭和转移能力减弱。由此认为，LOX促乳腺癌转移可能是通过下调MMP-2以及MMP-9得以实现的。LOX还能促进乳腺癌细胞的生长和增殖，有研究表明干扰LOX的表达后，乳腺癌细胞MDA-MB-231的Ki-67以及周期蛋白cyclin D1水平下调，这表明LOX促肿瘤细胞生长可能是通过上调Ki-67以及周期蛋白cyclin D1起作用的^[34]。Chen等^[35]研究检测到LOX表达的193例可检测到LOX表达的临床乳腺癌样本中，60%（n=120）的样本检测结果显示肿瘤组织中LOX表达量大于正常组织。研究结果还显示LOX抑制剂厚朴酚处理乳腺癌细胞后，其转移能力明显下降。肿瘤细胞是通过结合整合素完成与ECM的黏附，在黏附过程中黏附斑激酶（FAK）与桩蛋白（Src）磷酸化，从而导致黏附斑降解以及细胞迁移。厚朴酚抑制LOX后，乳腺癌细胞转移能力减弱，FAK/Src磷酸化减弱，这表明LOX可能通过促进肿瘤细胞对ECM的黏附而促肿瘤转移。

3 展望

胶原的翻译后修饰是胶原生物合成中至关重要的一步，关键的胶原修饰酶如P4HA1、P4HA2、PLOD2、LOX对胶原的生理功能以及肿瘤的进展都起着重要作用，见表 1。在一些实体瘤中胶原修饰酶异常表达，这可能使得修饰酶可以作为肿瘤的生物标志物或预后指标。胶原修饰酶在肿瘤发生发展尤其是侵袭转移中不可缺少，这为肿瘤转移的治疗提供了新靶点。虽然相关研究较多，但是确切机制尚未阐明，尤其是PLOD2以及P4HA2在肿瘤转移中的相关机制。因此，加强对胶原修饰酶与肿瘤进展的相关研究会为攻克肿瘤提供新的前景。